Två-foton Imaging av Cellular Dynamics i ryggmärgen hos möss
Summary
En ny ex vivo förberedelse för avbildning musen ryggmärgen. Detta protokoll möjliggör två-foton-avbildning av levande cellulära interaktioner hela ryggmärgen.
Abstract
Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.
Introduction
Musmodeller av demyelinisering, inklusive experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) och intrakraniell infektion med neuroadapted mus hepatitvirus (MHV), är utmärkta verktyg för att studera molekylära vägar och cellulära interaktioner förknippade med sjukdomen. De har lett till och stött effektivitet FDA godkända läkemedelsbehandlingar, främst inriktade upphörande av autoimmunitet och inflammation 1. Men när endogen remyelinisering har misslyckats, de närvarande godkända behandlingar inte effektivt reparera demyelinerade lesioner i det centrala nervsystemet. Därför reparationsfokuserade terapier i detta skede av sjukdomen är kritiska för lindring av kroniska symptom och förbättring av livskvaliteten. Nyligen har neurala prekursorceller (NPC) kommit i förgrunden som en potentiell regenerativ terapeutisk modalitet att rikta områden av inflammation och demyelinisering. Flera studier har visat på förmågan hos NPCs att inducera endogenooss remyelinisering och delta direkt i remyelinisering 2-8. Eftersom NPCs är involverade i direkt remyelinisering, är det absolut nödvändigt att förstå deras kinetik och interaktioner med endogena celler efter transplantation. Efter transplantation, NPCs migrera ventralt till områden av vit substans skada, sedan rostrally och kaudalt i förhållande till transplantation platsen 5,9. Kinetiken för migrationen skiljer som svar på miljösignaler; NPC transplanteras in i en icke-skadad ryggmärg har större hastigheter än NPC transplanteras till en skadad ryggmärg 6. Efter en vandrande period, överfört NPCs föröka i stor utsträckning, i högre takt i en skadad ryggmärg relativt en intakt ryggmärgen 6. Slutligen, majoriteten av NPC differentierar till oligodendrocyter och initiera direkt remyelinisering 4,6,9.
Den demyelinerad lesionen är komplex och kan innehålla en skiftande population av celler i olika skeden av enctivation. Till exempel kan en aktiv multipel skleros (MS) lesion omfattar en betydande population av aktiverade T-celler, M1 mikroglia och M1 makrofager, men en kronisk tyst MS lesionen kan bestå primärt av reaktiva astrocyter med få inflammatoriska celler 10-13. På grund av mångfalden av effektorceller, är två-foton (2P) avbildning i musmodeller av demyelinisering ett mycket användbart verktyg för att förstå lokala cellulära interaktioner inom lesionen. Vid MS och många utsträckning används MS forskningsmodeller, är majoriteten av lesioner som ligger på den ventrala sidan av ryggmärgen, en region oåtkomlig för intravital 2P avbildning på grund av skada djup och den höga fetthalten i ryggmärgen. För att kringgå dessa problem och studie cell-cell interaktioner inom lesioner längs den ventrala ryggmärgen har vi utvecklat en enkel ex vivo 2P avbildning förberedelse 6.
Denna studie följer upp en tidigare metoder publikation, vilket visadeförfarandet för omplantering förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) uttryckande NPC in i ryggmärgen av möss efter JHMV stam av MHV-inducerad demyelinisering 14. Fem veckor gamla möss infekterade med JHMV och transplanteras med eGFP-NPCs på thorax nivå 9 på dag 14 efter infektion. Protokollet presenteras här ger detaljerade steg för hur du extrahera ryggmärgen, gör en ex vivo -ig förberedelser, och bild transplanterade eGFP-NPC interaktioner med förstärkt gula fluorescerande protein (EYFP) uttryckande axoner. Möss som uttrycker EYFP under neuronala specifika Thy1 promotor användes i detta förfarande 15. Endast en del av de axoner uttrycka EYFP, vilket gör den användbar för avbildning enskilda axoner. Här visar vi ryggmärg avlägsnades vid 7 dagar efter transplantation; emellertid kan ryggmärg utvinnas vid någon tidpunkt efter transplantation. Medan vi visar interaktioner av NPCs med skadade axoner, kan våra protokoll användas i kombination med genetiska fluorescerande markörerav andra celltyper för att undersöka en mängd cellulära interaktioner inträffar hela musen ryggmärgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Realtids 2P avbildning av intakt vävnad krävs för att utreda NPC kinetik och interaktioner efter transplantation till demyelinerad musen ryggmärgen. Intravital 2P avbildning används ofta för att bestämma cellulära dynamiken på ryggsidan av ryggmärgen i levande möss, och har använts för att studera rygg demyelinisering i demyeliniserande sjukdom 17-19. Men eftersom transplanterade NPCs migrera till den ventrala vita substansen, som ligger för djupt för att bilden på plats med hjälp av 2P mikro…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by National Institutes of Health (NIH) Grants R01 GM-41514 (to M.D.C.), R39 GM-048071 (to I.P.), and R01 NS-074987 (to T.E.L.) and the National Multiple Sclerosis Society (NMSS) Collaborative Center Research Award CA1058-A-8 (to C.M.W., T.E.L. and M.D.C.), NMSS Grant RG4925, NIH Training Grant T32-AI-060573 (to M.L.G.), NMSS Postdoctoral Fellowship FG 1960-A-1 (to J.G.W.), and funding from the George E. Hewitt Foundation for Medical Research (M.P.M.).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care, Inc | N/A | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | sharp |
| scalpel blade #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Luer rongeurs | Fine Science Tools | 16001-15 | |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15615-08 | |
| scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 12-115F | |
| agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414-25G | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 1469SB | |
| 22 mm square cover slip | Fisher Scientific | 12-547 | |
| 25x dipping objective, 1.1 NA | Nikon | CFI Apo LWD 25XW | |
| Single inline solution heater | Warner Instruments | 64-0102 | |
| 520 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF520-Di02-25×36 | Brightline |
| 560 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF560-FDi01-25×36 | Brightline |
| photomultiplier tubes | Hamamatsu | R928 | |
| C/L variable-speed tubing pump | Masterflex | 77122-22 | |
| digital thermometer | Comar Instruments | 3501 | |
| Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser | Coherent | N/A | |
| Slidebook 6 software | 3i | N/A | |
| Imaris 7.7 software | Bitplane | N/A |
References
- Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment. Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).
- Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G. Regeneration and repair in multiple sclerosis: the role of cell transplantation. Neurosci Lett. 456 (3), 101-106 (2009).
- Hatch, M. N., Schaumburg, C. S., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Endogenous remyelination is induced by transplant rejection in a viral model of multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 212 (1-2), 74-81 (2009).
- Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 187 (2), 254-265 (2004).
- Tirotta, E., Carbajal, K. S., Schaumburg, C. S., Whitman, L., Lane, T. E. Cell replacement therapies to promote remyelination in a viral model of demyelination. J Neuroimmunol. 224 (1-2), 101-107 (2010).
- Greenberg, M. L., et al. Two-photon imaging of remyelination of spinal cord axons by engrafted neural precursor cells in a viral model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (22), E2349-E2355 (2014).
- Whitman, L. M., Blanc, C. A., Schaumburg, C. S., Rowitch, D. H., Lane, T. E. Olig1 function is required for remyelination potential of transplanted neural progenitor cells in a model of viral-induced demyelination. Exp Neurol. 235 (1), 380-387 (2012).
- Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).
- Weinger, J. G., et al. MHC mismatch results in neural progenitor cell rejection following spinal cord transplantation in a model of viral-induced demyelination. Stem Cells. 30 (11), 2584-2595 (2012).
- Vogel, D. Y., et al. Macrophages in inflammatory multiple sclerosis lesions have an intermediate activation status. J Neuroinflammation. 10, 35 (2013).
- Coyle, P. K., Rizvi, S. A., Coyle, P. K. Ch. 3. Clinical Neuroimmunology: Multiple Sclerosis and Related Disorders. 3, 43-70 (2011).
- McManus, C., et al. MCP-1, MCP-2 and MCP-3 expression in multiple sclerosis lesions: an immunohistochemical and in situ hybridization study. J Neuroimmunol. 86 (1), 20-29 (1998).
- Calderon, T. M., et al. A role for CXCL12 (SDF-1alpha) in the pathogenesis of multiple sclerosis: regulation of CXCL12 expression in astrocytes by soluble myelin basic protein. J Neuroimmunol. 177 (1-2), 27-39 (2006).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J Vis Exp. 53, e2834 (2011).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Nguyen, Q. T., Callamaras, N., Hsieh, C., Parker, I. Construction of a two-photon microscope for video-rate Ca(2+) imaging. Cell Calcium. 30 (6), 383-393 (2001).
- Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. 82, e50826 (2013).
- Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
- Pakan, J. M., McDermott, K. W. A method to investigate radial glia cell behavior using two-photon time-lapse microscopy in an ex vivo model of spinal cord development. Front Neuroanat. 8, 22 (2014).
- Fenrich, K. K., et al. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. J Physiol. 590 (Pt 16), 3665-3675 (2012).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336, 1676-1681 (2012).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (6089), 1869-1873 (2002).
- Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Curr Protoc Cytom. Chapter 12 (Unit12 26), (2012).
- Matheu, M. P., et al. Toll-like receptor 4-activated B cells out-compete Toll-like receptor 9-activated B cells to establish peripheral immunological tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), E1258-E1266 (2012).
- Matheu, M. P., et al. Three phases of CD8 T cell response in the lung following H1N1 influenza infection and sphingosine 1 phosphate agonist therapy. PLoS One. 8 (3), e58033 (2013).
