Method Article

Deux photons Imaging of Cellular Dynamics dans la moelle épinière de souris

DOI:

10.3791/52580

⸱

February 22nd, 2015

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1Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine, 2Physiology and Biophysics, University of California, Irvine, 3Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine, 4University of California San Francisco Diabetes Center, University of California, San Francisco, 5Pathology, University of Utah

In This Article

Summary

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Une nouvelle préparation ex vivo pour l'imagerie de la moelle épinière de souris. Ce protocole permet l'imagerie à deux photons d'interactions cellulaires vivants tout au long de la moelle épinière.

Abstract

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La microscopie à deux photons (2P) est utilisée pour révéler la dynamique cellulaire et les interactions profondes dans les tissus vivants et intacts. Ici, nous présentons une méthode d’imagerie de cellules vivantes dans la moelle épinière murine. Cette technique est particulièrement adaptée pour analyser la dynamique des cellules précurseurs neurales (NPC) après une transplantation dans la moelle épinière souffrant de troubles démyélinisants neuro-inflammatoires. Les NPC migrent vers les sites de lésions axonales, prolifèrent, se différencient en oligodendrocytes et participent à la remyélinisation directe. Les NPC constituent donc un traitement thérapeutique prometteur pour améliorer les maladies démyélinisantes chroniques. Étant donné que les NPC transplantés migrent vers les zones endommagées de la face ventrale de la moelle épinière, l’imagerie intravitale 2P traditionnelle est impossible, et seules les informations sur les interactions statiques étaient auparavant disponibles en utilisant les approches de coloration histochimique. Bien que cette méthode ait été générée pour imager des NPC transplantés dans la moelle épinière ventrale, elle peut être appliquée à de nombreuses études de cellules transplantées et endogènes dans toute la moelle épinière. Dans cet article, nous démontrons la préparation et l’imagerie d’une moelle épinière avec des axones exprimant des protéines fluorescentes jaunes améliorées et des NPC transplantés exprimant des protéines fluorescentes vertes améliorées.

Introduction

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Des modèles murins de démyélinisation, y compris l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) et l'infection par le virus intracrânienne neuroadapted de l'hépatite de la souris (MHV), sont d'excellents outils pour étudier les voies moléculaires et interactions cellulaires associés à la maladie. Ils ont mené et soutenu l'efficacité des thérapies pharmaceutiques approuvé par la FDA, ciblant principalement la cessation de l'auto-immunité et l'inflammation 1. Cependant, une fois la remyélinisation endogène a échoué, les thérapies actuellement approuvés ne réparent pas efficacement les lésions démyélinisées dans le système nerv....

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Protocol

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NOTE: Éthique Déclaration: Le protocole de manipulation des animaux a été approuvé par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) de l'Université de Californie, Irvine, le protocole # 2010-2943.

1. Suppression de la moelle épinière

  1. Placez des serviettes en papier mouillés avec ~ 100% d'isoflurane liquide, USP dans la chambre euthanasie et placer des serviettes en papier sec sur le dessus. Placez la souris dans la chambre au-dessus de serviettes en papier sèche afin souris ne est pas en contact avec le isoflurane et se assurer que la chambre est couverte. Attendre au moins une minute ....

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Results

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Alors que le protocole d'imagerie de la moelle épinière explantées peut être utilisé pour visualiser ne importe quel fluorescence de la moelle épinière, nos résultats démontrent représentatifs interactions avec eGFP-NPC-EYFP axones. Premièrement, nous montrons la préparation de la moelle épinière ventrale intégré à la figure 1A. Ensuite, on montre la configuration 2P du microscope et des éléments clés sur la figure 1B. La figure 2 illustre la fluorescence EGFP et l'EYFP dans un seul z-s.......

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Discussion

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En temps réel 2P imagerie du tissu intact est nécessaire pour enquêter sur la cinétique et interactions NPC après la transplantation dans la moelle épinière de souris démyélinisée. Imagerie intravitale 2P est couramment utilisé pour déterminer la dynamique cellulaire sur la face dorsale de la moelle épinière chez les souris vivant, et a été utilisé pour étudier dorsale démyélinisation maladie démyélinisante 17-19. Toutefois, en raison des PNJ transplantées migrent à la matière blanche ventrale, qui se trouve .......

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Disclosures

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Les auteurs n’ont pas d’intérêts concurrents.

Acknowledgements

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Ce travail a été soutenu en partie par les subventions R01 GM-41514 (à M.D.C.), R39 GM-048071 (à I.P.) et R01 NS-074987 (à T.E.L.) et la bourse de recherche du Centre collaboratif CA1058-A-8 de la National Multiple Sclerosis Society (NMSS) (à C.M.W., T.E.L. et M.D.C.), la subvention NMSS RG4925, la subvention de formation NIH T32-AI-060573 (à M.L.G.), Bourse postdoctorale NMSS FG 1960-A-1 (à J.G.W.), et financement de la Fondation George E. Hewitt pour la recherche médicale (M.P.M.).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Isoflurane, USPPiramal Critical Care, IncN/A
Ciseaux finsOutils de science fine14060-09tranchante
#10Outils de science fine10010-00
manche de scalpelOutils de science fine10003-12
Luer rongeursOutils de science fine16001-15
Graefe pinceFine Science Tools11052-10
Ciseaux VannasFine Science Tools15615-08
lame de scalpel #11Fine Science Tools10011-00
RPMI-1640Gibco12-115F
agarose, basse température de gélificationSigmaA9414-25G
ParafilmFisher Scientific13-374-12
Vetbond (adhésif tissu)3M1469SB
22 mm Lentille de recouvrement carréeFisher Scientific12-547
Objectif plongeur 25X, 1.1 NANikonCFI Apo LWD 25XW
Réchauffeur de solution unique en ligneWarner Instruments64-0102
520 nm Séparateur de faisceau dichroïque à un bordSemrockFF520-Di02-25x36
Brightline 560 nm séparateur de faisceau dichroïque à un seul bordSemrockFF560-FDi01-25x36Tubes
photomultiplicateursBrightline HamamatsuR928
C/L pompe à tube à vitesse variableMasterflex77122-22
Thermomètre numériqueComar Instruments3501
Chameleon Ultra Ti :Sapphire laser  ;CohérentN/A
Slidebook 6 logiciel3iN/A
Imaris 7.7 logicielBitplaneN/A
lame de scalpel

References

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  1. Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment. Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).
  2. Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G.

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