Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme
Summary
Fare omuriliği görüntülenmesi için yeni bir ex vivo hazırlık. Bu protokol, omurilik boyunca canlı hücresel etkileşimlerin iki foton görüntüleme için izin verir.
Abstract
Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.
Introduction
Deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE) ve neuroadapted fare hepatit virüsü (Geminin) ile intrakranial enfeksiyon dahil demiyelinizasyon Fare modelleri, moleküler yollar ve hastalıkla ilişkili hücresel etkileşimleri çalışmak için mükemmel araçlardır. Onlar yol ve FDA etkinliği ağırlıklı olarak otoimmünite ve inflamasyon 1 durması hedefleyen, ilaç tedavileri kabul desteklemiştir. Endojen remiyelinizasyon başarısız sonra, ancak, şu anda onaylanan terapiler, etkili bir şekilde, merkezi sinir sisteminde miyelin kaybetmiş lezyonlar, onarım yapmaz. Bu nedenle, hastalığın bu aşamada onarım odaklı tedaviler kronik semptomlar ve yaşam kalitesinin iyileştirilmesi giderilmesi için kritik öneme sahiptir. Son zamanlarda, nöral öncü hücreler (NPC) inflamasyon ve demiyelinizasyon alanları hedef potansiyel rejeneratif tedavi yöntemi olarak ön plana çıkmıştır. Çeşitli çalışmalar, endogeno indükleme NPC yeteneğini ortaya çıkarmıştırBize remiyelinizasyon ve remiyelinizasyon 2-8 doğrudan katılmak. NPC doğrudan remiyelinizasyon dahil Çünkü, bu nakli sonrası endojen hücreler ile kinetik ve etkileşimleri anlamak şarttır. Transplantasyon sonrası, NPC sonra rostrally ve nakli sitesine 5,9 kaudal göreli beyaz cevher hasarı alanları ile ventral göç. göç kinetik çevresel uyaranlara yanıt olarak farklılık; Olmayan bir hasar omuriliğe nakledilen NPC hasarlı omurilik 6 nakledilen NPC daha büyük hızlara sahip. Bir göç süre sonra, bir sağlıklı omurilik 6 bozuk bir omurilik nispetle daha yüksek bir hızda, NPC yaygın olarak çoğalırlar transfer edilir. Son olarak, NPC çoğunluğu oligodentrositlere farklılaştırmak ve doğrudan remiyelinizasyon 4,6,9 başlatmak.
miyelin kaybetmiş lezyon karmaşıktır ve çeşitli aşamalarında bir hücre, farklı popülasyon ihtiva edebilirctivation. Örneğin, bir aktif multipl skleroz (MS), lezyon aktive edilmiş T hücreleri, M1, mikroglia ve M1 makrofajlar, ancak kronik sessiz MS lezyon temel olarak birkaç enflamatuar hücreler 10-13 ile reaktif astrositler içerebilir önemli bir nüfus içerebilir. Çünkü efektör hücrelerin çeşitliliği, demiyelinizasyon fare modellerinde iki-foton (2P) görüntüleme lezyon içinde yerel hücresel etkileşimleri anlamak için son derece yararlı bir araçtır. MS ve birçok yaygın olarak kullanılan MS araştırma modellerinde, lezyonların çoğunluğu nedeniyle lezyon derinliği ve omurilik yüksek yağ içeriği omurilik, intravital 2P görüntüleme erişilemez bir bölge ventral tarafında yer almaktadır. Ventral spinal kord boyunca lezyonlarında bu konuları ve çalışma hücre-hücre etkileşimleri aşmak için biz ex vivo 2P görüntüleme hazırlık 6 basit geliştirdik.
Bu çalışma gösterdi Önceki yöntemler yayın, takipMHV kaynaklı demiyelinasyon 14 JHMV suşu ardından fare omuriliğe gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) -expressing NPC nakli için prosedür. Beş haftalık fareler JHMV ile enfekte ve gün 14 sonrası enfeksiyon torakal seviyede 9'da eGFP-NPC ile nakledilen. Burada sunulan protokol bir ex vivo agaroz hazırlık yapmak, omuriliği ayıklamak ve gelişmiş sarı floresan protein (EYFP) -expressing akson görüntü nakledilen eGFP-NPC etkileşimleri konusunda ayrıntılı adımları sağlar. Nöronal spesifik Thy1 promotörün kontrolü altında EYFP sentezleyen Fareler Bu prosedür 15 kullanılmıştır. Sadece akson bazı bireysel aksonlar görüntüleme için yararlı hale EYFP ifade eder. Burada 7 gün transplantasyon sonrası çıkarılmış omurilikleri göstermektedir; Bununla birlikte, omurilik transplantasyonundan sonra herhangi bir zaman noktasında elde edilebilir. Zarar görmüş aksonlar NPC etkileşimlerini gösterirken, protokol genetik floresan işaretler ile kombinasyon halinde de kullanılabilirdiğer hücre türleri fare omurilik oluşan hücresel etkileşimler çok sayıda araştırmak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gerçek zamanlı sağlam doku 2P görüntüleme demiyelinize fare omuriliğe nakli sonrası NPC kinetik ve etkileşimleri araştırmak için gereklidir. Intravital 2P görüntüleme yaygın yaşayan farelerde omurilik dorsal tarafında hücresel dinamikleri belirlemek için kullanılır, ve hastalık 17-19 demiyelinizan dorsal demiyelinizasyonu incelemek için kullanılır olmuştur. Transplant NPC 2P mikroskopi kullanılarak yerinde görüntüye çok derin yatıyor ventral beyaz cevher, göç Ancak, bir …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by National Institutes of Health (NIH) Grants R01 GM-41514 (to M.D.C.), R39 GM-048071 (to I.P.), and R01 NS-074987 (to T.E.L.) and the National Multiple Sclerosis Society (NMSS) Collaborative Center Research Award CA1058-A-8 (to C.M.W., T.E.L. and M.D.C.), NMSS Grant RG4925, NIH Training Grant T32-AI-060573 (to M.L.G.), NMSS Postdoctoral Fellowship FG 1960-A-1 (to J.G.W.), and funding from the George E. Hewitt Foundation for Medical Research (M.P.M.).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care, Inc | N/A | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | sharp |
| scalpel blade #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Luer rongeurs | Fine Science Tools | 16001-15 | |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15615-08 | |
| scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 12-115F | |
| agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414-25G | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 1469SB | |
| 22 mm square cover slip | Fisher Scientific | 12-547 | |
| 25x dipping objective, 1.1 NA | Nikon | CFI Apo LWD 25XW | |
| Single inline solution heater | Warner Instruments | 64-0102 | |
| 520 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF520-Di02-25×36 | Brightline |
| 560 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF560-FDi01-25×36 | Brightline |
| photomultiplier tubes | Hamamatsu | R928 | |
| C/L variable-speed tubing pump | Masterflex | 77122-22 | |
| digital thermometer | Comar Instruments | 3501 | |
| Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser | Coherent | N/A | |
| Slidebook 6 software | 3i | N/A | |
| Imaris 7.7 software | Bitplane | N/A |
References
- Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment. Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).
- Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G. Regeneration and repair in multiple sclerosis: the role of cell transplantation. Neurosci Lett. 456 (3), 101-106 (2009).
- Hatch, M. N., Schaumburg, C. S., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Endogenous remyelination is induced by transplant rejection in a viral model of multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 212 (1-2), 74-81 (2009).
- Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 187 (2), 254-265 (2004).
- Tirotta, E., Carbajal, K. S., Schaumburg, C. S., Whitman, L., Lane, T. E. Cell replacement therapies to promote remyelination in a viral model of demyelination. J Neuroimmunol. 224 (1-2), 101-107 (2010).
- Greenberg, M. L., et al. Two-photon imaging of remyelination of spinal cord axons by engrafted neural precursor cells in a viral model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (22), E2349-E2355 (2014).
- Whitman, L. M., Blanc, C. A., Schaumburg, C. S., Rowitch, D. H., Lane, T. E. Olig1 function is required for remyelination potential of transplanted neural progenitor cells in a model of viral-induced demyelination. Exp Neurol. 235 (1), 380-387 (2012).
- Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).
- Weinger, J. G., et al. MHC mismatch results in neural progenitor cell rejection following spinal cord transplantation in a model of viral-induced demyelination. Stem Cells. 30 (11), 2584-2595 (2012).
- Vogel, D. Y., et al. Macrophages in inflammatory multiple sclerosis lesions have an intermediate activation status. J Neuroinflammation. 10, 35 (2013).
- Coyle, P. K., Rizvi, S. A., Coyle, P. K. Ch. 3. Clinical Neuroimmunology: Multiple Sclerosis and Related Disorders. 3, 43-70 (2011).
- McManus, C., et al. MCP-1, MCP-2 and MCP-3 expression in multiple sclerosis lesions: an immunohistochemical and in situ hybridization study. J Neuroimmunol. 86 (1), 20-29 (1998).
- Calderon, T. M., et al. A role for CXCL12 (SDF-1alpha) in the pathogenesis of multiple sclerosis: regulation of CXCL12 expression in astrocytes by soluble myelin basic protein. J Neuroimmunol. 177 (1-2), 27-39 (2006).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J Vis Exp. 53, e2834 (2011).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Nguyen, Q. T., Callamaras, N., Hsieh, C., Parker, I. Construction of a two-photon microscope for video-rate Ca(2+) imaging. Cell Calcium. 30 (6), 383-393 (2001).
- Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. 82, e50826 (2013).
- Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
- Pakan, J. M., McDermott, K. W. A method to investigate radial glia cell behavior using two-photon time-lapse microscopy in an ex vivo model of spinal cord development. Front Neuroanat. 8, 22 (2014).
- Fenrich, K. K., et al. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. J Physiol. 590 (Pt 16), 3665-3675 (2012).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336, 1676-1681 (2012).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (6089), 1869-1873 (2002).
- Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Curr Protoc Cytom. Chapter 12 (Unit12 26), (2012).
- Matheu, M. P., et al. Toll-like receptor 4-activated B cells out-compete Toll-like receptor 9-activated B cells to establish peripheral immunological tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), E1258-E1266 (2012).
- Matheu, M. P., et al. Three phases of CD8 T cell response in the lung following H1N1 influenza infection and sphingosine 1 phosphate agonist therapy. PLoS One. 8 (3), e58033 (2013).
