हम माउस रेटिना के एक पूर्व विवो टुकड़ा तैयारी का उपयोग कर कोन फोटोरिसेप्टर के अक्षतंतु टर्मिनल में सीए 2 + गतिशीलता की निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन। इस प्रोटोकॉल एक महत्वपूर्ण स्तनधारी मॉडल प्रणाली में कोन सीए 2 + संकेतन का व्यापक अध्ययन, माउस की अनुमति देता है।
रेटिना कोन फोटोरिसेप्टर (शंकु) दिन के उजाले दृष्टि की सेवा और रंग भेदभाव का आधार हैं। वे अक्सर कई रेटिना रोगों में अंधापन के लिए अग्रणी, अध: पतन के अधीन हैं। कैल्शियम (सीए 2 +), फोटोरिसेप्टर संकेतन और चयापचय में एक महत्वपूर्ण दूसरे के दूत, परोक्ष रूप से विभिन्न पशु मॉडल में फोटोरिसेप्टर अध: पतन के साथ जुड़े होने के लिए प्रस्तावित किया गया है। व्यवस्थित शंकु शरीर क्रिया विज्ञान के इन पहलुओं का अध्ययन और pathophysiology विद्युत रेटिना रॉड फोटोरिसेप्टर का प्रभुत्व है जहां माउस में विशेष रूप से, इन छोटे कोशिकाओं से रिकॉर्डिंग की कठिनाइयों से प्रभावित किया गया है। इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए, हम शंकु में विशेष रूप से आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सीए 2 + biosensor तमिलनाडु एक्स्ट्रा लार्ज व्यक्त किया और फोटोरिसेप्टर अध: पतन के लिए माउस मॉडल के साथ संकर जा सकता है कि एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन का उपयोग कर एक दो फोटॉन सीए 2 + इमेजिंग प्रोटोकॉल की स्थापना की। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल खड़ी वर्गों की तैयारी शामिल है (आर20; चूहों और शंकु सीए 2 + स्तर में प्रकाश उत्तेजना पैदा परिवर्तन के ऑप्टिकल इमेजिंग से रेटिना के स्लाइस ")। प्रोटोकॉल भी पूर्ण सीए 2 + सांद्रता के "में टुकड़ा माप" की अनुमति देता है; रिकॉर्डिंग अंशांकन द्वारा पीछा किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल कार्यात्मक शंकु गुणों में पढ़ाई के लिए सक्षम बनाता है और शंकु की समझ सीए 2 + संकेत के रूप में अच्छी तरह से फोटोरिसेप्टर मौत और रेटिना अध: पतन में सीए 2 + की संभावित भागीदारी के लिए योगदान करने की उम्मीद है।
विजन रेटिना फोटोरिसेप्टर में phototransduction झरना का प्रकाश प्रेरित सक्रियण के साथ शुरू होता है। कोन फोटोरिसेप्टर रंग और उच्च संकल्प दिन के उजाले दृष्टि मध्यस्थता जबकि रॉड फोटोरिसेप्टर, कम रोशनी स्तरों पर दृष्टि अनुमति देते हैं। कई फोटोरिसेप्टर विशिष्ट जीन इन कोशिकाओं का अध: पतन के लिए नेतृत्व कि म्यूटेशन के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। फोटोरिसेप्टर नुकसान के साथ जुड़े आणविक मार्कर के एक नंबर 1 की पहचान की गई है, लेकिन अभी तक विस्तृत आणविक तंत्र और घटनाओं के अनुक्रम अस्पष्ट रहते हैं। बदल सीए 2 + समस्थिति फोटोरिसेप्टर कोशिका मृत्यु का एक ट्रिगर, अध: पतन की प्रक्रिया 2,3 दौरान सीए की गतिविधि 2 + निर्भर Calpain प्रकार प्रोटिएजों की अप-विनियमन द्वारा समर्थित एक परिकल्पना होने का अनुमान लगाया गया था। हालांकि, आज तक, इस परिकल्पना सीए 2 + की शारीरिक माप के द्वारा समर्थित नहीं है। पुनः में सीए 2 + चैनल ब्लॉकर्स के प्रभाव पर कई अध्ययनों में विसंगतियांtinal रोगों आगे सीधे स्तनधारी कोन फोटोरिसेप्टर में सीए 2 + का आकलन करने के तरीकों के लिए बुला रही है, कोशिका मृत्यु 4-6 में सीए 2 + की भागीदारी को चुनौती दी।
इससे पहले, सबसे अधिक बिजली रिकॉर्डिंग और सीए 2 + इमेजिंग अध्ययन क्योंकि शंकु 7-9 के लिए आसान पहुँच के उभयचर और साँप मॉडल में प्रदर्शन किया गया है। हालांकि, स्तनधारी फोटोरिसेप्टर फिजियोलॉजी गैर स्तनधारी 10 और विशेष रूप से अलग हो सकता है, मानव वंशानुगत रेटिना अध: पतन के संदर्भ में, स्तनधारी फोटोरिसेप्टर शरीर क्रिया विज्ञान का एक बेहतर समझ अभिनव उपचार के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। मानव रेटिना रोगों नकल उतार कई माउस मॉडल उपलब्ध हैं, लेकिन थोड़ा माउस शंकु 11 में सीए 2 + गतिशीलता के बारे में जाना जाता है। विद्युत तकनीक विशेष रूप से नहीं चूहों में, शंकु से उच्च throughput रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त नहीं हैं, जहां छड़ (~ 97%) काफी कोन (~ 3%) संख्या से बढ़ना 12 </s> ऊपर। इसके अलावा, इस तरह के पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के रूप में संवेदनशील electrophysiological तकनीक इंट्रासेल्युलर परिवेश को परेशान और निरपेक्ष इंट्रासेल्युलर सीए 2 + सांद्रता पर सीए 2 + धाराओं पर डेटा लेकिन नहीं प्रदान करते हैं। कोन सीए 2 + गतिशीलता के बारे में सवालों को संबोधित इसलिए, जब कम अस्थायी समाधान के बावजूद, इमेजिंग पसंद की विधि है। इमेजिंग के साथ प्रमुख मुद्दा चुनिंदा एक फ्लोरोसेंट सीए 2 + सूचक डाई के साथ शंकु लेबल करने के लिए कैसे है। उचित compartmentalization और सेल विशिष्टता के ऊतकों में "थोक लोड हो रहा है" सिंथेटिक सीए 2 + सूचक रंगों से प्राप्त करने के लिए कठिन है। एक परिणाम के लेबल, शंकु के रूप में, 13,14 छड़, और मुलर glial कोशिकाओं मज़बूती से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, सिंथेटिक रंगों के अनुरूप शर्तों के तहत लंबे समय तक रिकॉर्डिंग रोकने, कोशिकाओं के बाहर रिसाव के लिए करते हैं। यह डे की आवश्यकता के रूप में इसके अलावा, उनके पूर्वाह्न-एस्टर रूप में सिंथेटिक सीए 2 + संकेतक लोड हो रहा है, समस्याग्रस्त हैtergents (जैसे, DMSO) और formaldehyde 15 उत्पन्न करता है। पूर्ण सीए 2 + माप के लिए, ratiometric संकेतक अनिवार्य हैं। हालांकि, सबसे अच्छा वर्तमान में उपलब्ध कृत्रिम ratiometric सूचक Fura-2 इसकी तीव्रता पर निर्भर करता है, अपने आप में शंकु को बढ़ावा, और इस प्रकार की पढ़ाई बाधित कर सकते हैं, जो 760 एनएम के लिए 700 की रेंज में उत्तेजना प्रकाश (दो photon उत्तेजना के लिए), की आवश्यकता है कोन सीए शारीरिक रोशनी की शर्तों के तहत 2 + गतिशीलता।
सिंथेटिक रंगों के विपरीत, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सीए 2 + संकेतक एक प्रकार की कोशिका-चयनात्मक तरीके से व्यक्त किया जा सकता है। वे कोशिकाओं के बाहर लीक नहीं करते, और विरंजन बचा है, तो इसलिए, लंबे समय तक और विश्वसनीय ratiometric माप संभव हो रहे हैं। दो photon माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त जब सेल प्रकार चयनात्मक सीए 2 + biosensors के अभिव्यक्ति, काफी हद तक शारीरिक स्थितियों 13,16,17 के तहत सीए 2 + आकलन और subcellular अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है </> समर्थन। यहाँ, हम प्रकाश उत्तेजना पैदा शंकु सीए अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन एक ट्रांसजेनिक सीए 2 + biosensor माउस लाइन में 2 + गतिशीलता: झल्लाहट आधारित सीए 2 + biosensor तमिलनाडु एक्स्ट्रा लार्ज 18 को व्यक्त करता है जो (HR2.1 तमिलनाडु एक्स्ट्रा लार्ज), चुनिंदा शंकु में, मानव लाल opsin के प्रमोटर HR2.1 19 के तहत। कोन टर्मिनलों का उपयोग करने के लिए, एक पूर्व विवो टुकड़ा तैयारी 20 नियोजित किया गया था। प्रोटोकॉल पहले से ही सफलतापूर्वक स्वस्थ चूहों 10,21,22 में कोन समारोह पर तीन अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया था। इसके अलावा, प्रोटोकॉल शंकु सीए का अध्ययन करने की अनुमति देता है 2 + जैसे विशिष्ट आनुवंशिक स्थितियों में संकेत, HR2.1 साथ वंशानुगत रेटिना अध: पतन के लिए माउस मॉडल crossbreeding द्वारा: तमिलनाडु एक्स्ट्रा लार्ज चूहों।
Electrophysiological एकल कक्ष रिकॉर्डिंग या सिंथेटिक फ्लोरोसेंट संकेतक के साथ सीए 2 + इमेजिंग का उपयोग पूर्व मौजूदा प्रोटोकॉल तकनीकी कारणों से (परिचय देखें) के एक नंबर के लिए माउस कोन फोटोरिसेप्टर में सीए 2 + गतिशीलता रिकॉर्ड करने के लिए संघर्ष। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल सीए 2 + संकेतों और एक कुशल और अपेक्षाकृत सरल तरीके से व्यक्ति की पहचान माउस शंकु टर्मिनलों में भी पूर्ण सीए 2 + स्तर की माप की अनुमति देता है।
इस प्रोटोकॉल पहले से ही सफलतापूर्वक स्वस्थ माउस रेटिना में शंकु समारोह के विभिन्न पहलुओं को संबोधित तीन अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है। पहले अध्ययन में 10 में, HR2.1: तमिलनाडु एक्स्ट्रा लार्ज माउस सीए 2 + biosensor के कोन-विशिष्ट अभिव्यक्ति में बाधा नहीं है कि दिखा, immunohistochemistry, एर्ग रिकॉर्डिंग, दो photon सीए 2 + इमेजिंग, और औषध विज्ञान का उपयोग कर विशेषता थी कोन शारीरिक रचना और कार्य करते हैं। दूसरे अध्ययन 21 में, रंगीनऔर माउस शंकु की अवर्णी प्रतिक्रिया गुण "हरी" opsin बहुल पृष्ठीय और "ब्लू" opsin बहुल उदर माउस रेटिना के बीच कोन समारोह में हड़ताली मतभेद का प्रदर्शन, रेटिना भर में मैप किया गया। कोन गुणों में ये क्षेत्रीय मतभेद माउस शंकु के विभिन्न प्रकार के वर्णक्रम इस प्रकार, अवर्णी विरोधाभासों (पास) इष्टतम नमूना लेने के लिए प्रदान करते हैं और सुझाव है कि प्राकृतिक वातावरण में अंतर विपरीत वितरण (यानी, जमीन बनाम आकाश) मिलान, एक पेशकश कर सकते हैं विकासवादी लाभ। कोन अक्षतंतु टर्मिनलों क्षैतिज कोशिकाओं से प्राप्त होने वाले तीसरे अध्ययन 22 पारस्परिक प्रतिक्रिया में जांच की गई। सभी प्रस्तावित क्षैतिज सेल प्रतिक्रिया तंत्र शंकु अक्षतंतु टर्मिनलों 28 में वोल्टेज-गेटेड सीए 2 + चैनलों पर कार्रवाई के रूप में, कोन टर्मिनल सीए 2 + क्षैतिज सेल के लिए कोन बातचीत के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में सेवा कर सकते हैं। Kemmler और से अध्ययन 22 का समर्थन करता है सहकर्मियोंदेखें क्षैतिज कोशिकाओं फोटोरिसेप्टर ग्लूटामेट रिहाई को नियंत्रित करने के लिए कई तंत्र जिसमें एक जटिल राय प्रणाली का उपयोग करें।
इन अध्ययनों से वर्णित प्रोटोकॉल की चंचलता को वर्णन है और यह कोन समारोह और उसके अन्तर्ग्रथनी सर्किट से संबंधित प्रश्नों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल शंकु शरीर क्रिया विज्ञान का एक बेहतर समझ की दिशा में, अलग शंकु डिब्बों में स्थानीय सीए 2 + संकेतन का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है। इस तरह के ज्ञान अंततः शंकु को प्रभावित करने अपक्षयी रोगों के लिए विशेष रूप से, संभावित चिकित्सकीय दृष्टिकोण के तर्कसंगत विकास के लिए अनुमति देने के लिए, degenerating शंकु में pathophysiological प्रक्रियाओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।
HR2.1 में: तमिलनाडु एक्स्ट्रा लार्ज माउस लाइन, सीए 2 + biosensor बाहरी खंड के अपवाद के साथ, शंकु भर में व्यक्त किया जाता है। इस CA 2 + गतिशील के प्रत्यक्ष और ratiometric आकलन के लिए एक अवसर प्रदान करता हैअलग शंकु डिब्बों में एस। सीए में परिवर्तन के बाद से बाहरी क्षेत्र में 2 + धाराओं झिल्ली क्षमता और वोल्टेज-गेटेड सीए 2 + चैनलों के परिणामस्वरूप सक्रियण के माध्यम से टर्मिनलों में परिलक्षित होते हैं, बाहरी क्षेत्र में प्रक्रियाओं परोक्ष रूप से देखा जा सकता है।
संभावित ख़तरे:
रेटिना के विच्छेदन एक महत्वपूर्ण कदम है: माउस में रेटिना आमतौर पर फोटोरिसेप्टर बाहरी क्षेत्रों और वर्णक उपकला के बीच eyecup से अलग करती है। इसलिए, अलग रेटिना के प्रकाश के प्रति संवेदनशील फोटोरिसेप्टर बाहरी क्षेत्रों उजागर कर रहे हैं और यांत्रिक क्षति के प्रति बेहद संवेदनशील। महान देखभाल उपकरणों के साथ फोटोरिसेप्टर पक्ष छूकर या एक चिपकने वाला सतह पर बग़ल में (उदाहरण के लिए, एक फिल्टर झिल्ली) ऊतक को ले जाकर नुकसान नहीं लिया जाना चाहिए।
उच्च गुणवत्ता वाले रेटिना स्लाइस उनकी साफ काटने की सतह से माइक्रोस्कोप के तहत मान्यता प्राप्त किया जा सकता है औरस्पष्ट रूप से परिभाषित बाहरी क्षेत्रों के साथ एक अच्छी तरह से संगठित फोटोरिसेप्टर परत से। टुकड़ा गुणवत्ता के कार्यात्मक मूल्यांकन जल्दी से (- 20 शंकु 10 के साथ देखने का एक क्षेत्र में, उदाहरण के लिए) उज्ज्वल प्रकाश उत्तेजनाओं चमकती और उत्तरदायी शंकु का प्रतिशत निर्धारित किया जा सकता है। इधर, प्रतिक्रिया की गुणवत्ता के संकेत करने वाली शोर अनुपात (एस / एन) (प्रकाश प्रतिक्रिया के आयाम बनाम प्रकाश उत्तेजना से पहले आधारभूत शोर के आयाम) की गणना के द्वारा मूल्यांकन किया जाना चाहिए; एक एस / 2 के एन – 3 न्यूनतम सीमा के रूप में माना जाना चाहिए। आमतौर पर, हम कम से कम 50% उत्तरदायी शंकु के साथ स्लाइस त्यागें। इसके अलावा अत्यधिक सहज spiking के व्यवहार (10 में चित्रा 4 देखें) त्याग किया जाना चाहिए कि प्रदर्शन शंकु के साथ स्लाइस।
Aforementioned के संरचनात्मक और कार्यात्मक मानदंडों को पूरा करती रिकॉर्डिंग कक्ष में स्लाइस 1 के लिए लगातार प्रतिक्रियाएं शो – 2 घंटा (प्रतिक्रिया स्थिरता पर जानकारी के लिए, 10 देखें)। स्लाइस घंटे के लिए जीवित रहने की वजहपकड़े कक्ष में हमारा, एक सफल प्रयोग 6 घंटा के लिए पिछले कर सकते हैं। यह टुकड़ा करने की क्रिया को अनिवार्य रूप से रेटिना नेटवर्क में पार्श्व कनेक्शन severs के रूप में शंकु और क्षैतिज कोशिकाओं के बीच लंबे समय से लेकर स्थानिक बातचीत का अध्ययन करने के लिए सम्मान के साथ कुछ प्रतिबंध है, कि वहाँ उल्लेखनीय है। हालांकि, 300 माइक्रोन के लिए रेटिना स्लाइस की मोटाई में वृद्धि इस मुद्दे पर 22 ameliorates।
खड़ी रेटिना स्लाइस के उपयोग काफी हद तक (10,21 देखते हैं, व्यापक चर्चा के लिए) opsin विरंजन से बचाता है, इस प्रकार, उत्तेजना लेजर द्वारा प्रकाश के प्रति संवेदनशील शंकु बाहरी क्षेत्रों की स्कैनिंग से बचा जाता है और। फिर भी, दर्ज की गई सीए 2 + संकेतों न केवल प्रकाश उत्तेजनाओं पर निर्भर करती है, लेकिन यह भी स्कैनिंग उत्तेजना लेजर द्वारा उत्पन्न एक पृष्ठभूमि रोशनी घटक से प्रभावित हो। वास्तव में, इस तरह के दो photon इमेजिंग प्रयोगों में प्रभावी पृष्ठभूमि रोशनी बिखरे हुए लेजर प्रकाश, दर्ज सीई द्वारा उत्सर्जित फ्लोरोसेंट रोशनी का एक संयोजन हैLLS, और किसी भी एलईडी प्रोत्साहन पृष्ठभूमि घटक। रिकॉर्डिंग करने से पहले (चालू होने पर प्रकाश प्रोत्साहन की पृष्ठभूमि घटक के साथ) लेजर स्कैनिंग के लिए 30 एस – इसलिए, शंकु कम से कम 20 के लिए अनुकूल करने की अनुमति दी जानी चाहिए।
फायदे और अनुप्रयोगों:
शंकु में रास्ते संकेतन 2 + सीए को मान्य हो सकता है कोन सीए 2 + इमेजिंग के साथ संयोजन में औषधीय अध्ययन और हो सकता है: इस शंकु सीए 2 + -imaging प्रोटोकॉल के लिए कुछ अनुप्रयोगों 10,21,22 ऊपर वर्णित किया गया है, जबकि अन्य अनुप्रयोगों की कल्पना की जा सकती है प्रभावकारिता और सीए में विभिन्न खिलाड़ियों को लक्षित दवाओं की शक्ति का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल 2 + 10 -signaling। हालांकि, एक प्रमुख आवेदन शंकु समारोह को प्रभावित रोगों का अध्ययन करने के लिए हो सकता है। मानव रोगों नकल उतार कई रेटिना अध: पतन माउस मॉडल उपलब्ध हैं। उदाहरण के लिए, कोन फोटोरिसेप्टर नुकसान 1 (cpfl 1) माउस एक प्राथमिक शंकु अध: पतन मॉडल पीड़ा हैएक Pde6c उत्परिवर्तन 29 से। इसके विपरीत, रॉड अध: पतन 1 (आरडी 1) माउस एक Pde6b उत्परिवर्तन से ग्रस्त है। इस प्राथमिक रॉड फोटोरिसेप्टर अध: पतन 30, 1 में आरडी 1 रॉड नुकसान पूरा हो गया है एक बार, माध्यमिक शंकु अध: पतन का कारण बनता सेट है। HR2.1 साथ इन जानवरों crossbreeding: तमिलनाडु एक्स्ट्रा लार्ज लाइन का अध्ययन और दोनों को प्राथमिक और माध्यमिक शंकु अध: पतन में सीए 2 + गतिशीलता की तुलना की अनुमति है और कोन सेल मौत के दौरान सीए 2 + की भूमिका में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए की संभावना है जाएगा। इसके अलावा, औषधीय शंकु अध: पतन प्रेरित – उदाहरण के लिए चयनात्मक PDE6 अवरोधकों का उपयोग कर – शंकु अध: पतन 10,29,31 के बहाव के तंत्र की पहचान करने के लिए सेवा कर सकता है।
सारांश में, प्रोटोकॉल यहां माउस कोन फोटोरिसेप्टर के subcellular डिब्बों में सीए 2 + मापने की अनुमति देता है और एक विस्तृत श्रृंखला के तहत शंकु शरीर क्रिया विज्ञान को उजागर करने के लिए महान अवसर प्रस्तुत वर्णितशारीरिक और pathophysiological शर्तों की। साथ ही, इस प्रोटोकॉल शंकु सीए 2 + -signaling के साथ हस्तक्षेप है और इस तरह शंकु रोगों के लिए नए उपचारों स्थापित करने में मदद करने के लिए डिजाइन औषधीय एजेंटों की स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience Tübingen, EXC 307 to T.E. and T.S.; KFO 134 to B.W. and F.P.D.), the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF) (BCCN Tübingen, FKZ 01GQ1002 to T.E and T.B.), and the European Union (DRUGSFORD; HEALTH-F2-2012-304963 to M.K. and F.P.D).
High vacuum grease | Dow Corning | 1018817 | http://www.dowcorning.com |
Cover slips | R. Langenbrinck | 24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com | |
Glass slides | R. Langenbrinck | 76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com | |
Blades for tissue chopper | MARTOR KG | ARGENTAX No. 1044 | 0.25 mm; http://www.martor.de |
Tissue chopper | Custom-build | Based on a design by F. Werblin23, adapted by T. Schubert | |
Nitrocellulose filter membrane gridded | Merck Millipore | AABG01300 | Filter type: 0.8 µm; http://www.emdmillipore.com |
Isoflurane CP | CP pharma | AP/DRUGS/220/96 | http://www.cp-pharma.de |
UV/green LED-based full-field stimulator | Custom-build | for details, see10 | |
Open source microprocessor board | Arduino | http://www.arduino.cc | |
Imaging software CfNT | Custom-written | developed by Michael Müller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany | |
IgorPro | Wavemetrics | http://www.wavemetrics.com | |
VC3-4 System focal perfusion system | ALA Scientific Instrument | with 100 μm-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/ | |
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser) | Newport Spectra-Physics | http://www.spectra-physics.com | |
Movable objective microscope (MOM), Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany |
Sutter Instruments | http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html | |
XLUMPlanFL 20x/0.95w objective | Olympus | http://www.olympusamerica.com | |
Vaporizer 100 series | Surgivet | http://www.surgivet.com | |
Ionomycin, Calcium salt | Life technologies | I24222 | http://www.lifetechnologies.com |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | https://www.sigmaaldrich.com |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 101191250 | http://www.sigmaaldrich.com |
Leica MZ95 | leica microsystems | http://www.leica-microsystems.com/ |