Long Term Intravital multiphoton Microscopy Imaging af immunceller i rask som syg Lever Brug CXCR6.Gfp Reporter Mus
Summary
Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.
Abstract
Lever inflammation som reaktion på skade er en meget dynamisk proces, der involverer infiltration af distinkte undertyper af leukocytter, herunder monocytter, neutrofiler, T-celle-delmængder, B-celler, naturlige dræberceller (NK) og NKT-celler. Intravital mikroskopi af leveren til overvågning immuncellemigrering er særligt udfordrende på grund af de høje krav til prøveforberedelse og fiksering, optisk opløsning og langsigtet dyr overlevelse. Alligevel kunne dynamikken i inflammatoriske processer samt cellulære interaktionsundersøgelser give vigtige oplysninger til bedre at forstå indledningen, progression og regression af inflammatorisk leversygdom. Derfor er en meget følsom og pålidelig metode blev etableret for at undersøge migration og celle-celle-vekselvirkninger i forskellige immunceller i muselever over lange perioder (ca. 6 timer) ved intravital to-foton laser scanning mikroskopi (TPLSM) i kombination med intensiv pleje overvågning.
ent "> Den angivne fremgangsmåde indbefatter en blid forberedelse og stabil fiksering af leveren med minimal forstyrrelse af organ, langsigtede intravital billeddannelse ved hjælp af flerfarvet multiphoton mikroskopi med næsten ingen fotoblegning eller fototoksiske virkninger over en periode på op til 6 timer, så sporing af specifikke leukocytundergrupper, og stabile billeddiagnostiske betingelser på grund af omfattende overvågning af mus vitale parametre og stabilisering af cirkulation, temperatur og gasudveksling.For at undersøge lymfocytmigration ved leverbetændelse CXCR6.gfp knock-in-mus blev udsat for intravital billeddannelse af leveren under baseline betingelser og efter akut og kronisk leverskade induceret ved intraperitoneal injektion (r) carbontetrachlorid (CCI4).
CXCR6 er en kemokinreceptor udtrykt på lymfocytter, primært på Natural Killer T (NKT) -, Natural Killer (NK) – og undergrupper af T-lymfocytter som CD4 T-celler, men også slimhinder associeredeated invariant (MAIT) T-celler 1. Efter den vandrende mønster og positionering af CXCR6.gfp + immunceller tilladt et detaljeret indblik i deres ændrede adfærd på leverskade og dermed deres potentielle engagement i sygdomsprogression.
Introduction
Visualiseringen af celler og cellulære funktioner i hele organer eller endda hele organismer har været af stor interesse for mere end 50 år, herunder stort set alle dele af kroppen 2. Derfor nogle tidlige undersøgelser, der allerede er ansat intravital billeddannelse af leveren 3,4. Der findes imidlertid flere begrænsninger ajour om langsigtet stabil høj opløsning billeddannelse af levervæv.
På grund af den anatomiske placering af leveren i tæt kontakt med membranen og mavetarmkanalen 5, den mest almindelige problem for mikroskopisk intravital billeddannelse er bevægelse på grund af respiration og, i mindre omfang, peristaltisk af tarmkanalen 6. I sammenligning med andre faste organer, lever kirurgi er en særlig udfordring. På grund af den tætte mikrovaskulære struktur, kan kirurgisk manipulation føre til massive blødende læsioner, nedsat mikrocirkulation 7 og også aktivering af bosiddende immune celler såsom Kupffer-celler 8. Derfor mekanisk fiksering af vævet som offentliggjort andetsteds 6,9 kan forventes at påvirke den intravital mikroskopi billeddannelse.
I en sund lever, 10-15% af det samlede blodvolumen bor i leveren vaskulatur, og organet modtager omkring 25% af den samlede minutvolumen 10, gør organet stærkt modtagelige for ændringer i kredsløbet (f.eks udsving blodtryk ). Derfor vil forstyrrelser i det hepatiske blodgennemstrømning som følge af f.eks shear stress, forskydning, skade ved overdreven væv håndtering eller centraliseret cirkulation føre til kunstige ændringer i leukocyt vandringsadfærd, nedsat lever- iltning og dermed yderligere skade lever, påvirker leveren immunreaktioner samt som orgel bevarelse og den samlede levetid af dyret.
Tidlige mikroskopiske undersøgelser var baseret på intravital epifluorescens microscopy, men flere tekniske begrænsninger, såsom foto blegning og lav indtrængningsdybde begrænse brugen af denne teknik for langsigtet lever imaging 4,11,12. Med udviklingen af multiphoton mikroskopi i 1990'erne, blev begrænsningerne i foto blegning eller indtrængningsdybde primært løst, da denne nye metode var teknisk i stand til at udføre billeddiagnostiske undersøgelser i næsten alle organer i henhold til det virkelige liv situationer 13-15. Men de vigtigste tilbageværende udfordringer med hensyn til lever imaging var: ånde bevægelser, autofluorescens af levervæv, sikring uændret blodgennemstrømningen i de hepatiske sinusoider, og især stabil billeddannelse i længere perioder på flere timer 16.
Selvom flere undersøgelser rettet funktionen og migration af forskellige leukocytter i leveren 17, fx NKT-celler 18-20, T-celler 21,22, lever makrofager 23,24 eller neutrofiler 25, langsigtet multiphoton microscopy billeddannelse endnu ikke blevet oprettet, en opgave endnu mere udfordrende i dyr med akut eller kronisk leversygdom på grund af den eksisterende skader og derfor højere følsomhed over for yderligere skader 26. Men overvågning vandrende adfærd og cellulære funktion af leukocytter i leveren i realtid giver nye indsigter i deres særlige rolle i lever homeostase og sygdom 27.
Kemokinreceptoren CXCR6 udtrykkes på flere lymfocytundergrupper, herunder naturlige dræberceller (NK-celler), NKT-celler og nogle T-cellepopulationer 18,28. Tidligere undersøgelser af mus har indikeret, at CXCR6 og dens beslægtede ligand CXCL16 kan styre patruljering af NKT celler på lever sinusoids under homøostase. Derfor har anvendelsen af CXCR6.gfp mus (der bærer en knock-in for grønt fluorescerende protein [GFP] i CXCR6 locus) blevet beskrevet at undersøge migrationen af lymfocytter i forskellige organer, såsom hjernen 29og også leveren 18,20, viser forøget infiltration af CXCR6.gfp celler efter inflammation.
Med metoden i denne undersøgelse var det muligt at følge disse processer i en lang periode under stabiliserede forhold. Den intravital multiphoton baseret procedure tilladt imaging, der var meget reproducerbar med minimal forstyrrelse af dyre- og orglet; optimeret til langsigtet dyr overlevelse ved omfattende overvågning efterfulgt af nøje kontrol med åndedræt og cirkulation; og meget fleksibel og let at også vedtage andre parenkymale organer såsom nyrer og milt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Formålet med vores undersøgelse var at udvikle en meget standardiseret, stabil og reproducerbar metode til intravital TPLSM billeddannelse af leveren. Intravital billeddannelse i almindelighed har givet værdifuld indsigt i cellulære opførsel under virkelige liv betingelser efter målsøgende og interaktion mellem forskellige leukocytpopulationer i udvikling, homeostase og sygdom. Men den noget udfordrende anatomiske position af leveren, skyldes som respiratorisk og peristaltisk tarm bevægelse direkte overføres ti…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Central Animal facility of the University Hospital Aachen for technical support. This work was supported by the German Research Foundation (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) and by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen. This work was further supported by the Core Facility ”Two-Photon Imaging”, a Core Facility of the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen within the Faculty of Medicine at RWTH Aachen University.
Materials
| Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Fentanyl | Rotex Medica | charge: 30819 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| Glucose 5% | Braun | ||
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ketamin 10% | ceva | Charge: 36217/09 | |
| Xylazin 2% | medistar | Charge: 04-03-9338/23 | |
| Consumable supplies | |||
| 20ml Syringe | BD Plastipak | ||
| 250ml Erlenmeyer flask | Schott Duran | 21 226 36 | |
| 25mL Beaker 2x | Schott Duran | 50-1150 | |
| 2ml syringe | BD Plastipak | ||
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V7980 | |
| Agarose | commercially available | ||
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit | Fine Science Tools Inc. | 18010-00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Cover Slip 24x50mm | ROTH | 1871 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Feather disposable scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Fine Bore Polythene Tubing 0,58mm ID | Smiths medical | 800/100/200 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | 5x 0,5ml |
| Leukoplast | BSN Medical Inc. | ||
| Microscope Slides | ROTH | 1879 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G x 1 | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G x 1 | B. Braun | 4657705 | |
| Tissue paper | commercially available | ||
| Surgical Instruments | |||
| Amalgam burnisher 3PL | Gatz | 0110? | |
| Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 | Storz&Klein | S-01134 | |
| Dumont No.7 forceps | Fine Science Tools Inc. | 91197-00 | |
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight x2 | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Heidemann spatula HD2 | Stoma | 2030.00 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| ECG Trigger Unit | Rapid Biomedical | 3000003686 | |
| MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer | AD Instruments | ||
| Minivent Typ 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
| Multiphoton microscope Trimscope I | LaVision | ||
| Perfusor Compact | B. Braun | ||
| PowerLab 8/30 8 channel recorder | AD Instruments | PL3508 | |
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Temperature sensor | comercially available | ||
| Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box | Life Imaging Services |
References
- Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).
- Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
- Bhathal, P. S., Christie, G. S. Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs. Gut. 10 (11), 955 (1969).
- Stefenelli, N. Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy. Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Tanaka, K., et al. Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy. Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).
- Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest. Transpl Int. 13, S525-S527 (2000).
- Schemmer, P., et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).
- Toiyama, Y., et al. Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy. J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).
- Zimmon, D. S. The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis. Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).
- Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).
- Bonder, C. S., et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).
- Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Amore, J. D., et al. In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).
- Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver–challenges to the multi-step paradigm. Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).
- McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy. J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).
- Geissmann, F., et al. Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids. PLoS Biology. 3 (4), (2005).
- Velázquez, P., et al. Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids. J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).
- Wehr, A., et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).
- Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets. Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).
- Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
- Beattie, L., et al. Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation. Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6 (3), e1000805 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
- Vanheule, E., et al. An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis. Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).
- Jenne, C. N., Kubes, P. Immune surveillance by the liver. Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).
- Zimmermann, H. W., Tacke, F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).
- Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
- Karlmark, K. R., et al. Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis. Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).
- Heymann, F., et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice. Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).
- Ramachandran, P., et al. Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).
- Moles, A., et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse. J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).
- Hammerich, L., et al. Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis. Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).
- Syn, W. -. K., et al. NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).
- McDonald, B., et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids. J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).
- Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).
- Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes. Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).
- Khandoga, A. G., et al. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS One. 4 (3), e4693 (2009).
