À long terme intravitale microscopie multiphotonique imagerie des cellules immunitaires dans sains et malades du foie en utilisant des souris CXCR6.Gfp Reporter
Summary
Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.
Abstract
inflammation du foie en tant que réponse à une blessure est un processus hautement dynamique impliquant l'infiltration des sous-types distincts de leucocytes, y compris les monocytes, les neutrophiles, les sous-ensembles de cellules T, les cellules B, les cellules tueuses naturelles (NK) et des cellules NKT. Microscopie intravitale du foie pour le suivi de la migration des cellules immunitaires est particulièrement difficile en raison des exigences élevées en ce qui concerne la préparation des échantillons et la fixation, la résolution optique et la survie des animaux à long terme. Pourtant, la dynamique des processus inflammatoires ainsi que des études d'interaction cellulaires pourraient fournir des informations cruciales pour mieux comprendre l'initiation, la progression et la régression de la maladie inflammatoire du foie. Par conséquent, une méthode très sensible et fiable a été créé pour étudier la migration et cellule-cellule-interactions de cellules immunitaires différentes dans le foie de souris sur de longues périodes (environ 6 h) par intravitale deux photons microscopie à balayage laser (TPLSM) en combinaison avec des soins intensifs surveillance.
ent "> Le procédé proposé comprend une préparation douce et la fixation stable du foie avec une perturbation minimale de l'organe; imagerie intravitale à long terme en utilisant multicolore multiphotonique microscopie avec pratiquement pas de photoblanchiment ou des effets phototoxiques sur une période de temps allant jusqu'à 6 heures, ce qui permet un suivi de sous-ensembles de leucocytes spécifiques et des conditions de formation d'image stable en raison de la surveillance des paramètres vitaux extensif de souris et de stabilisation de la circulation, la température et l'échange de gaz.Pour étudier la migration des lymphocytes à une inflammation du foie CXCR6.gfp souris knock-in ont été soumis à l'imagerie du foie intravitale dans des conditions de base et après des lésions du foie aiguë et chronique induite par injection intraperitoneale (s) de tétrachlorure de carbone (CCl 4).
CXCR6 est un récepteur de chimiokine exprimée sur les lymphocytes, principalement sur tueuses naturelles T (NKT) -, Natural Killer (NK) – et des sous-ensembles de lymphocytes T telles que les cellules T CD4 mais aussi asso muqueusesATED invariant des cellules (MAIT) T 1. Suivant le modèle migratoire et le positionnement de CXCR6.gfp + cellules immunitaires permis un aperçu détaillé dans leur changement de comportement lors d'une lésion du foie et donc leur implication potentielle dans la progression de la maladie.
Introduction
La visualisation des cellules et des fonctions cellulaires dans des organes entiers, voire des organismes entiers a été d'un grand intérêt pour les plus de 50 ans, y compris presque toutes les parties du corps 2. Par conséquent, certaines études antérieures déjà employés imagerie intravitale du foie 3,4. Cependant, plusieurs limitations existent à jour concernant stable à long terme imagerie à haute résolution des tissus du foie.
En raison de la position anatomique du foie en contact étroit avec la membrane et le tractus gastro-intestinal 5, le problème le plus commun pour l'imagerie microscopique intravitale mouvement est due à la respiration et, dans une moindre mesure, péristaltique de l'intestin 6. En comparaison à d'autres organes solides, la chirurgie du foie est particulièrement difficile. En raison de la structure microvasculaire dense, manipulation chirurgicale peut entraîner des lésions hémorragiques massifs, troubles de la microcirculation 7 et également l'activation de résident immune cellules telles que des cellules de Kupffer 8. Par conséquent, la fixation mécanique du tissu telle que publiée ailleurs 6,9 est susceptible d'interférer avec l'imagerie par microscopie intravitale.
Dans un foie en bonne santé, de 10 à 15% du volume total de sang réside dans le système vasculaire du foie, et l'organe reçoit l'ordre de 25% de la production globale cardiaque 10, rendant l'organe très sensible aux variations de la circulation (par exemple, les fluctuations de la pression artérielle ). Par conséquent, les perturbations dans le flux sanguin hépatique due à par exemple, contrainte de cisaillement, de déplacement, de blessure par une manipulation excessive des tissus ou la circulation centralisée seront conduire à des altérations artificielles dans leucocytes comportement migratoire, troubles de l'oxygénation du foie et donc également des dommages au foie, affecter les réponses immunitaires du foie ainsi comme conservation d'organes et de la durée de vie globale de l'animal.
Études microscopiques étaient fondés sur km à épifluorescence intravitalecroscopy, mais plusieurs contraintes techniques telles que le blanchiment photo et une faible profondeur de pénétration limiter l'utilisation de cette technique pour le long terme imagerie du foie 4,11,12. Avec le développement de la microscopie multiphotonique dans les années 1990, les limites de la photo blanchiment ou la profondeur de pénétration ont principalement été résolus, que cette nouvelle méthode était techniquement capable d'effectuer des études d'imagerie dans pratiquement tous les organes dans des situations de la vie réelle de 13 à 15. Toutefois, les principaux défis à relever en ce qui concerne l'imagerie du foie étaient: mouvements de respiration, autofluorescence des tissus du foie, de fixation flux sanguin inchangée dans les sinusoïdes hépatiques, et l'imagerie particulièrement stable pour des périodes de plusieurs heures 16 plus longues.
Bien que plusieurs études ont abordé la fonction et la migration des différents leucocytes dans le foie, par exemple, 17 cellules NKT 18-20, les cellules T 21,22, les macrophages du foie 23,24 ou 25 neutrophiles, long terme multiphotonique mimagerie icroscopy ne avait pas encore été établie avec succès, une tâche encore plus difficile chez les animaux atteints de maladie hépatique aiguë ou chronique en raison des dommages existants et la susceptibilité donc supérieur à 26 autres dommages. Toutefois, le suivi du comportement migratoire et la fonction cellulaire de leucocytes dans le foie en temps réel permet de nouvelles perspectives dans leur rôle particulier dans l'homéostasie du foie et la maladie 27.
Le CXCR6 des récepteurs de chimiokines est exprimé sur plusieurs sous-ensembles de lymphocytes, y compris les cellules tueuses naturelles (NK), les cellules NKT et certaines populations de cellules T 18,28. Des études antérieures sur des souris ont indiqué que CXCR6 et son CXCL16 de ligand apparenté peuvent contrôler les patrouilles des cellules NKT sur sinusoïdes du foie lors de l'homéostasie. Par conséquent, l'utilisation de souris CXCR6.gfp (portant un knock-in de la protéine verte fluorescente [GFP] dans le locus CXCR6) a été décrite pour étudier la migration des lymphocytes dans divers organes tels que le cerveau 29et aussi le foie 18,20, montrant l'infiltration de cellules CXCR6.gfp augmenté sur l'inflammation.
Avec la méthode prévue dans cette étude, il était possible de suivre ces processus sur une longue période de temps dans des conditions stables. La procédure basée multiphotonique intravitale permis imagerie qui était très reproductible avec une perturbation minimale de l'animal et l'organe; optimisé pour la survie des animaux à long terme par une surveillance importante suivie d'un contrôle étroit de la respiration et de la circulation; et très flexible et facile à adopter aussi à d'autres organes parenchymateux tels que le rein ou de la rate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le but de notre étude était de développer une méthode très standardisé, stable et reproductible pour l'imagerie intravitale TPLSM du foie. Imagerie intravitale en général a donné de précieuses indications sur le comportement cellulaire dans des conditions réelles suivantes homing et l'interaction des différentes populations de leucocytes dans le développement, l'homéostasie et la maladie. Cependant, la position anatomique peu difficile du foie, en raison de laquelle respiratoire et le mouvement…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Central Animal facility of the University Hospital Aachen for technical support. This work was supported by the German Research Foundation (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) and by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen. This work was further supported by the Core Facility ”Two-Photon Imaging”, a Core Facility of the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen within the Faculty of Medicine at RWTH Aachen University.
Materials
| Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Fentanyl | Rotex Medica | charge: 30819 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| Glucose 5% | Braun | ||
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ketamin 10% | ceva | Charge: 36217/09 | |
| Xylazin 2% | medistar | Charge: 04-03-9338/23 | |
| Consumable supplies | |||
| 20ml Syringe | BD Plastipak | ||
| 250ml Erlenmeyer flask | Schott Duran | 21 226 36 | |
| 25mL Beaker 2x | Schott Duran | 50-1150 | |
| 2ml syringe | BD Plastipak | ||
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V7980 | |
| Agarose | commercially available | ||
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit | Fine Science Tools Inc. | 18010-00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Cover Slip 24x50mm | ROTH | 1871 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Feather disposable scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Fine Bore Polythene Tubing 0,58mm ID | Smiths medical | 800/100/200 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | 5x 0,5ml |
| Leukoplast | BSN Medical Inc. | ||
| Microscope Slides | ROTH | 1879 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G x 1 | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G x 1 | B. Braun | 4657705 | |
| Tissue paper | commercially available | ||
| Surgical Instruments | |||
| Amalgam burnisher 3PL | Gatz | 0110? | |
| Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 | Storz&Klein | S-01134 | |
| Dumont No.7 forceps | Fine Science Tools Inc. | 91197-00 | |
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight x2 | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Heidemann spatula HD2 | Stoma | 2030.00 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| ECG Trigger Unit | Rapid Biomedical | 3000003686 | |
| MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer | AD Instruments | ||
| Minivent Typ 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
| Multiphoton microscope Trimscope I | LaVision | ||
| Perfusor Compact | B. Braun | ||
| PowerLab 8/30 8 channel recorder | AD Instruments | PL3508 | |
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Temperature sensor | comercially available | ||
| Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box | Life Imaging Services |
References
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