Long Term intravitale Multiphoton Microscopia Imaging di cellule immunitarie in sani e malati di fegato Uso Mice CXCR6.Gfp Reporter
Summary
Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.
Abstract
Fegato infiammazione come risposta al danno è un processo altamente dinamico che coinvolge l'infiltrazione di distinti sottotipi di leucociti tra cui monociti, neutrofili, sottogruppi di cellule T, cellule B, natural killer (NK) e le cellule NKT. Microscopia intravitale del fegato per monitorare la migrazione delle cellule immunitarie è particolarmente difficile a causa degli elevati requisiti per quanto riguarda la preparazione del campione e la fissazione, risoluzione ottica e animale sopravvivenza a lungo termine. Tuttavia, la dinamica dei processi infiammatori così come studi di interazione cellulare potrebbe fornire informazioni fondamentali per comprendere meglio l'iniziazione, la progressione e la regressione della malattia epatica infiammatoria. Pertanto, un metodo altamente sensibile ed affidabile è stato istituito per studiare migrazione e cellula-cellula-interazioni di diverse cellule immunitarie in fegato di topo per lunghi periodi (circa 6 ore) di intravitale due fotoni microscopia a scansione laser (TPLSM) in combinazione con terapia intensiva monitoraggio.
ent "> Il metodo fornito comprende una preparazione dolce e fissazione stabile del fegato con il minimo turbamento dell'organo; di imaging intravitale lungo termine utilizzando la microscopia multicolor multiphoton praticamente senza photobleaching o effetti fototossici per un periodo di tempo massimo di 6 ore, consentendo il monitoraggio di specifici sottoinsiemi di leucociti, e le condizioni di imaging stabile a causa monitoraggio estensivo di topo parametri vitali e la stabilizzazione della circolazione, la temperatura e lo scambio di gas.Per studiare la migrazione dei linfociti su infiammazione del fegato CXCR6.gfp knock-in topi sono stati sottoposti a esami del fegato intravitale in condizioni basali e dopo danno epatico acuto e cronico indotto da un'iniezione intraperitoneale (s) di tetracloruro di carbonio (CCL 4).
CXCR6 è un recettore per chemochine espressi sui linfociti, soprattutto su Natural Killer T (NKT) -, Natural Killer (NK) – e sottoinsiemi di linfociti T come le cellule T CD4 ma anche Associ mucoseATED invariante cellule (MAIT) T 1. Seguendo il modello migratorio e il posizionamento di CXCR6.gfp + cellule immunitarie permesso una visione dettagliata del loro comportamento alterato sul danno epatico e quindi il loro potenziale coinvolgimento nella progressione della malattia.
Introduction
La visualizzazione delle cellule e funzioni cellulari di organi interi o persino interi organismi è stato di grande interesse per più di 50 anni, tra cui quasi tutte le parti del corpo 2. Pertanto, alcuni primi studi già impiegati l'imaging intravitale del fegato 3,4. Tuttavia, alcune limitazioni esistono aggiornati riguardo a lungo termine ad alta risoluzione stabile di imaging di tessuto epatico.
A causa della posizione anatomica del fegato in stretto contatto con il diaframma e il tratto gastrointestinale 5, il problema più comune per l'imaging microscopico intravitale è movimento dovuto alla respirazione e, in misura minore, peristaltica del tratto intestinale 6. In confronto ad altri organi solidi, chirurgia epatica è particolarmente impegnativo. A causa della struttura microvascolare densa, manipolazione chirurgica può portare a massicce lesioni emorragiche, alterata microcircolazione 7 e anche l'attivazione di residente icellule mmune come le cellule di Kupffer 8. Pertanto, fissaggio meccanico del tessuto come pubblicato altrove 6,9 rischia di interferire con imaging microscopia intravitale.
In un fegato sano, 10-15% del volume totale del sangue risiede all'interno del sistema vascolare del fegato, e l'organo riceve circa il 25% della gittata cardiaca complessiva 10, rendendo l'organo altamente sensibili alle variazioni di circolazione (ad esempio, variazioni di pressione sanguigna ). Di conseguenza, le interruzioni nel flusso epatico causa ad esempio, shear stress, spostamento, lesioni da uso eccessivo tessuto o circolazione centralizzata porterà ad alterazioni artificiali in leucociti comportamento migratorio, ridotta ossigenazione del fegato e quindi ulteriori danni al fegato, che colpisce fegato risposte immunitarie come pure come conservazione dell'organo e la durata complessiva dell'animale.
I primi studi microscopici erano basati su mi epifluorescenza intravitalemicroscopia, ma molti vincoli tecnici, quali foto sbiancamento e la profondità di penetrazione bassa limitano l'uso di questa tecnica per il lungo termine l'imaging del fegato 4,11,12. Con lo sviluppo della microscopia multiphoton nel 1990, le limitazioni della foto sbianca o profondità di penetrazione erano principalmente risolti, come questo nuovo metodo era tecnicamente in grado di svolgere studi di imaging in quasi tutti gli organi sotto situazioni reali 13-15. Tuttavia, le principali sfide rimanenti rispetto all'imaging fegato sono stati: i movimenti del respiro, autofluorescenza di tessuto epatico, che fissano inalterato il flusso di sangue nelle sinusoidi epatici, e di imaging particolarmente stabile per un periodo di diversi hr 16 più lunghi.
Anche se diversi studi hanno affrontato la funzione e la migrazione dei vari leucociti nel fegato 17, ad esempio, NKT cellule 18-20, le cellule T 21,22, i macrofagi del fegato 23,24 o neutrofili 25, a lungo termine multiphoton mImaging icroscopy non era ancora stato stabilito con successo, un compito ancora più impegnativo in animali affetti da malattia epatica acuta o cronica a causa dei danni esistente e quindi maggiore suscettibilità a ulteriori danni 26. Tuttavia, il monitoraggio comportamento migratorio e la funzione cellulare dei leucociti nel fegato in tempo reale consente nuove intuizioni nel loro ruolo specifico nella omeostasi del fegato e malattie 27.
Il CXCR6 recettore delle chemochine è espresso in diverse sottopopolazioni linfocitarie, tra cui natural killer (NK), le cellule NKT e alcune popolazioni di cellule T 18,28. Precedenti studi sui topi hanno indicato che CXCR6 e la sua CXCL16 ligando affine possono controllare il pattugliamento delle cellule NKT su sinusoidi del fegato durante l'omeostasi. Di conseguenza, l'uso di topi CXCR6.gfp (portando un knock-in della proteina fluorescente verde [GFP] nel locus CXCR6) è stata descritta per studiare la migrazione dei linfociti in vari organi come il cervello 29e anche il fegato 18,20, mostrando aumento infiltrazione di cellule CXCR6.gfp su infiammazione.
Con il metodo fornito in questo studio è stato possibile seguire questi processi per un lungo periodo di tempo in condizioni stabilizzate. La procedura basata multiphoton intravitale permesso di imaging che era altamente riproducibile con il minimo turbamento dell'animale e l'organo; ottimizzata per il lungo termine animali sopravvivenza da un ampio monitoraggio seguito da vicino il controllo della respirazione e della circolazione; e altamente flessibile e facile da adottare anche ad altri organi parenchimatosi come il rene, milza.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo scopo del nostro studio è stato quello di sviluppare un metodo altamente standardizzato, stabile e riproducibile per l'imaging intravitale TPLSM del fegato. Imaging intravitale in generale ha dato preziose informazioni sul comportamento cellulare in condizioni di vita reale seguenti homing e l'interazione di diverse popolazioni di leucociti nello sviluppo, omeostasi e la malattia. Tuttavia, la posizione anatomica piuttosto impegnativa del fegato, a causa della quale respiratorio e movimento intestinale peris…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Central Animal facility of the University Hospital Aachen for technical support. This work was supported by the German Research Foundation (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) and by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen. This work was further supported by the Core Facility ”Two-Photon Imaging”, a Core Facility of the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen within the Faculty of Medicine at RWTH Aachen University.
Materials
| Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Fentanyl | Rotex Medica | charge: 30819 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| Glucose 5% | Braun | ||
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ketamin 10% | ceva | Charge: 36217/09 | |
| Xylazin 2% | medistar | Charge: 04-03-9338/23 | |
| Consumable supplies | |||
| 20ml Syringe | BD Plastipak | ||
| 250ml Erlenmeyer flask | Schott Duran | 21 226 36 | |
| 25mL Beaker 2x | Schott Duran | 50-1150 | |
| 2ml syringe | BD Plastipak | ||
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V7980 | |
| Agarose | commercially available | ||
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit | Fine Science Tools Inc. | 18010-00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Cover Slip 24x50mm | ROTH | 1871 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Feather disposable scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Fine Bore Polythene Tubing 0,58mm ID | Smiths medical | 800/100/200 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | 5x 0,5ml |
| Leukoplast | BSN Medical Inc. | ||
| Microscope Slides | ROTH | 1879 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G x 1 | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G x 1 | B. Braun | 4657705 | |
| Tissue paper | commercially available | ||
| Surgical Instruments | |||
| Amalgam burnisher 3PL | Gatz | 0110? | |
| Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 | Storz&Klein | S-01134 | |
| Dumont No.7 forceps | Fine Science Tools Inc. | 91197-00 | |
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight x2 | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Heidemann spatula HD2 | Stoma | 2030.00 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| ECG Trigger Unit | Rapid Biomedical | 3000003686 | |
| MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer | AD Instruments | ||
| Minivent Typ 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
| Multiphoton microscope Trimscope I | LaVision | ||
| Perfusor Compact | B. Braun | ||
| PowerLab 8/30 8 channel recorder | AD Instruments | PL3508 | |
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Temperature sensor | comercially available | ||
| Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box | Life Imaging Services |
References
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