Long Term Intravital Multiphoton Microscopia de imagem de células imunes no saudáveis e doentes do fígado por meio CXCR6.Gfp Reporter Mice
Summary
Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.
Abstract
Inflamação do fígado como uma resposta à lesão é um processo altamente dinâmico envolvendo a infiltração de subtipos distintos de leucócitos incluindo monócitos, neutrófilos, subconjuntos de células T, células B, células assassinas naturais (NK) e as células NKT. Microscopia intravital do fígado para monitorar a migração de células imunes é particularmente desafiador devido às altas exigências em matéria de preparação de amostras e fixação, resolução óptica e sobrevivência dos animais no longo prazo. No entanto, a dinâmica dos processos inflamatórios, assim como estudos de interacção celular poderia fornecer informações importantes para compreender melhor o início, a progressão e regressão da doença inflamatória do fígado. Portanto, um método altamente sensível e confiável foi criada para estudar a migração e célula-célula-interações de células imunes diferentes em fígado de rato durante longos períodos (cerca de 6 h) por dois fótons de microscopia de varredura a laser intravital (TPLSM) em combinação com tratamento intensivo monitorização.
ent "> O método fornecido inclui uma preparação suave e fixação estável do fígado com perturbação mínima do órgão; imagiologia intravital longo prazo usando microscopia multiphoton multicolor com praticamente nenhuma fotodegradação ou efeitos fototóxicos, durante um período de até 6 horas, permitindo rastreamento de subconjuntos de leucócitos específicos; e condições de imagem estável devido à ampla fiscalização do rato parâmetros vitais e estabilização da circulação, temperatura e troca gasosa.Para investigar a migração de linfócitos após a inflamação do fígado CXCR6.gfp ratinhos knock-in foram submetidos a imagiologia do fígado intravital em condições basais e após os danos do fígado aguda e crónica induzida por injecção intraperitoneal (s) de tetracloreto de carbono (CCl 4).
CXCR6 é um receptor de quimiocina expressa em linfócitos, principalmente em Natural T assassinas (NKT) -, Natural Killer (NK) – e subconjuntos de linfócitos T, tais como células T CD4 +, mas também asso mucosasated invariante células (MAIT) T 1. Seguindo o padrão migratório e posicionamento de CXCR6.gfp + células imunes permitiu uma visão detalhada sobre o seu comportamento alterado após a lesão hepática e, portanto, o seu potencial envolvimento na progressão da doença.
Introduction
A visualização de células e as funções celulares em órgãos inteiros ou até mesmo de organismos inteiros tem sido de grande interesse para mais de 50 anos, incluindo praticamente todas as partes do corpo 2. Por isso, alguns estudos iniciais já empregaram imagens intravital do fígado 3,4. No entanto, existem várias limitações atualizado sobre estável imagens de alta resolução a longo prazo do tecido do fígado.
Devido à posição anatómica do fígado em estreito contacto com o diafragma e o tracto gastrointestinal 5, o problema mais comum para imagiologia intravital microscópica é o movimento devido à respiração e, em menor grau, peristáltica do tracto intestinal 6. Em comparação com outros órgãos sólidos, cirurgia do fígado é particularmente desafiador. Devido à estrutura microvascular densa, manipulação cirúrgica pode conduzir a lesões hemorrágicas maciças, microcirculação comprometida 7 e também a activação de residente immune células, tais como células de Kupffer 8. Portanto, a fixação mecânica do tecido como publicado anteriormente 6,9 é susceptível de interferir com a imagem de microscopia intravital.
Em um fígado saudável, 10-15% do volume total de sangue reside dentro da vasculatura hepática, e o órgão recebe cerca de 25% do débito cardíaco geral 10, tornando o órgão altamente susceptíveis a mudanças na circulação (por exemplo, flutuações de pressão arterial ). Portanto, as interrupções no fluxo sanguíneo hepático devido, por exemplo, tensão de cisalhamento, deslocamento, lesão por manuseio excessivo dos tecidos ou circulação centralizada vai levar a alterações artificiais no comportamento migratório de leucócitos, deficiente oxigenação fígado e, portanto, mais danos ao fígado, afetando as respostas imunes do fígado, bem como preservação de órgãos e tempo de vida total do animal.
Os primeiros estudos microscópicos foram baseados em mi epifluorescência intravitalcroscopy, mas várias restrições técnicas, tais como o branqueamento foto e baixa profundidade de penetração limitar o uso desta técnica para imagiologia do fígado a longo prazo 4,11,12. Com o desenvolvimento da microscopia multiphoton na década de 1990, as limitações de branqueamento foto ou profundidade de penetração foram principalmente resolvido, já que este novo método era tecnicamente capaz de realizar estudos de imagem em praticamente todos os órgãos em situações da vida real 13-15. No entanto, os principais desafios que subsistem no que diz respeito à geração de imagens de fígado foram: movimentos de respiração, autofluorescência do tecido do fígado, protegendo o fluxo sanguíneo inalterado nos sinusóides hepáticos, e de imagem especialmente estáveis por longos períodos de várias horas 16.
Apesar de vários estudos abordaram a função e migração de vários leucócitos no fígado 17, por exemplo, a NKT células-18-20, células T 21,22, os macrófagos do fígado 23,24 ou neutrófilos 25, a longo prazo multiphoton mimaging icroscopy ainda não tinha sido estabelecida com sucesso, uma tarefa ainda mais difícil em animais com doença hepática aguda ou crônica devido ao dano existente e, portanto, maior susceptibilidade a danos maiores 26. No entanto, monitorando o comportamento migratório e função celular de leucócitos no fígado em tempo real, permite que novas idéias em seu papel especial na homeostase do fígado e doença 27.
O receptor de quimiocina CXCR6 é expresso em vários subconjuntos de linfócitos, incluindo células assassinas naturais (NK), as células NKT e algumas populações de células T 18,28. Estudos anteriores em ratos indicaram que CXCR6 e sua CXCL16 ligando cognato pode controlar o patrulhamento de células NKT em sinusóides hepáticos durante a homeostase. Por conseguinte, a utilização de ratinhos CXCR6.gfp (transportando um knock-in de proteína fluorescente verde [GFP] no locus CXCR6) tem sido descrita para investigar a migração de linfócitos em vários órgãos tais como o cérebro 29e também fígado 18,20, mostrando aumento da infiltração de células CXCR6.gfp sobre a inflamação.
Com o método proporcionado no presente estudo foi possível seguir estes processos durante um longo período de tempo sob condições estabilizadas. O procedimento baseado multiphoton intravital permitido de imagem que foi altamente reprodutível com perturbação mínima do animal e do órgão; otimizado para a sobrevivência dos animais a longo prazo através de monitoramento extensa, seguida de perto o controle da respiração e circulação; e altamente flexível e fácil de adoptar igualmente para outros órgãos parenquimatosos, tais como de rim ou baço.
Protocol
Representative Results
Discussion
O objetivo do nosso estudo foi desenvolver um método altamente padronizada, estável e reprodutível para a imagem latente TPLSM intravital do fígado. Imaging Intravital em geral deu informações valiosas sobre o comportamento celular sob condições reais seguintes homing e interação de diferentes populações de leucócitos em desenvolvimento, a homeostase e da doença. No entanto, a posição anatómica um pouco difícil de fígado, devido a que movimento respiratório e intestinal peristáltica são transmitido…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Central Animal facility of the University Hospital Aachen for technical support. This work was supported by the German Research Foundation (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) and by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen. This work was further supported by the Core Facility ”Two-Photon Imaging”, a Core Facility of the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen within the Faculty of Medicine at RWTH Aachen University.
Materials
| Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Fentanyl | Rotex Medica | charge: 30819 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| Glucose 5% | Braun | ||
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ketamin 10% | ceva | Charge: 36217/09 | |
| Xylazin 2% | medistar | Charge: 04-03-9338/23 | |
| Consumable supplies | |||
| 20ml Syringe | BD Plastipak | ||
| 250ml Erlenmeyer flask | Schott Duran | 21 226 36 | |
| 25mL Beaker 2x | Schott Duran | 50-1150 | |
| 2ml syringe | BD Plastipak | ||
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V7980 | |
| Agarose | commercially available | ||
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit | Fine Science Tools Inc. | 18010-00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Cover Slip 24x50mm | ROTH | 1871 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Feather disposable scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Fine Bore Polythene Tubing 0,58mm ID | Smiths medical | 800/100/200 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | 5x 0,5ml |
| Leukoplast | BSN Medical Inc. | ||
| Microscope Slides | ROTH | 1879 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G x 1 | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G x 1 | B. Braun | 4657705 | |
| Tissue paper | commercially available | ||
| Surgical Instruments | |||
| Amalgam burnisher 3PL | Gatz | 0110? | |
| Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 | Storz&Klein | S-01134 | |
| Dumont No.7 forceps | Fine Science Tools Inc. | 91197-00 | |
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight x2 | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Heidemann spatula HD2 | Stoma | 2030.00 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| ECG Trigger Unit | Rapid Biomedical | 3000003686 | |
| MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer | AD Instruments | ||
| Minivent Typ 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
| Multiphoton microscope Trimscope I | LaVision | ||
| Perfusor Compact | B. Braun | ||
| PowerLab 8/30 8 channel recorder | AD Instruments | PL3508 | |
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Temperature sensor | comercially available | ||
| Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box | Life Imaging Services |
References
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