Largo Plazo intravital Multifotónica de imágenes de microscopía de células inmunitarias en sanos y enfermos de hígado utilizando ratones CXCR6.Gfp Reporter
Summary
Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.
Abstract
Inflamación del hígado como respuesta a una lesión es un proceso altamente dinámico que implica la infiltración de distintos subtipos de leucocitos incluyendo monocitos, neutrófilos, subconjuntos de células T, células B, células asesinas naturales (NK) y las células NKT. Microscopía intravital del hígado para el seguimiento de la migración de células inmunes es particularmente difícil debido a los altos requisitos relativos a la preparación de muestras y fijación, la resolución óptica y la supervivencia de los animales a largo plazo. Sin embargo, la dinámica de los procesos inflamatorios, así como estudios de interacción celulares podrían proporcionar información crítica para comprender mejor la iniciación, progresión y regresión de la enfermedad inflamatoria del hígado. Por lo tanto, se estableció un método altamente sensible y fiable para estudiar la migración y célula-célula-interacciones de las diferentes células inmunes en el hígado del ratón durante períodos largos (alrededor de 6 hr) por intravital de dos fotones microscopía de escaneo láser (TPLSM) en combinación con cuidados intensivos monitoreo.
ent "> El método proporcionado incluye una preparación suave y una fijación estable del hígado con perturbación mínima del órgano; intravital de imágenes a largo plazo usando microscopía multifotónica multicolor con prácticamente ninguna photobleaching o efectos fototóxicos durante un período de tiempo de hasta 6 horas, lo que permite el seguimiento de subconjuntos de leucocitos específicos, y las condiciones de imagen estable debido a un seguimiento exhaustivo de los parámetros vitales del ratón y la estabilización de la circulación, la temperatura y el intercambio de gases.Para investigar la migración de linfocitos en la inflamación del hígado CXCR6.gfp ronda en ratones fueron sometidos a formación de imágenes del hígado intravital en condiciones basales y después de daño hepático agudo y crónico inducida por la inyección intraperitoneal (s) de tetracloruro de carbono (CCl 4).
CXCR6 es un receptor de quimioquinas expresado en los linfocitos, principalmente en células T asesinas naturales (NKT) -, asesinas naturales (NK) – y subconjuntos de linfocitos T, como las células T CD4, sino también associ mucosasATED invariante células (MAIT) T 1. Siguiendo el patrón migratorio y el posicionamiento de las células inmunes CXCR6.gfp + permitido una visión detallada de su comportamiento alterado en la lesión hepática y por lo tanto su potencial implicación en la progresión de la enfermedad.
Introduction
La visualización de las células y las funciones celulares en órganos enteros o incluso organismos enteros ha sido de gran interés durante más de 50 años, incluyendo prácticamente todas las partes del cuerpo 2. Por lo tanto, algunos de los primeros estudios que ya emplean intravital de imágenes del hígado 3,4. Sin embargo, existen varias limitaciones al día en cuanto a imágenes de alta resolución estable a largo plazo del tejido hepático.
Debido a la posición anatómica del hígado en estrecho contacto con el diafragma y el tracto gastrointestinal 5, el problema más común para formación de imágenes intravital microscópico es el movimiento debido a la respiración y, en menor medida, peristáltica del tracto intestinal 6. En comparación con otros órganos sólidos, la cirugía del hígado es particularmente difícil. Debido a la estructura microvascular densa, la manipulación quirúrgica puede conducir a lesiones hemorrágicas masivas, alteración de la microcirculación 7 y también la activación de residente immune células tales como las células de Kupffer 8. Por lo tanto, la fijación mecánica del tejido que se publica en otra parte 6,9 es probable que interfiera con la formación de imágenes de microscopía intravital.
En un hígado sano, el 10-15% del volumen total de sangre reside dentro de la vasculatura del hígado, y el órgano recibe alrededor de 25% del gasto cardíaco en general 10, haciendo que el órgano altamente susceptibles a cambios en la circulación (por ejemplo, fluctuaciones de la presión arterial ). Por lo tanto, las interrupciones en el flujo sanguíneo hepático debido a, por ejemplo, la tensión de cizallamiento, el desplazamiento, la lesión por la manipulación excesiva de los tejidos o la circulación centralizada dará lugar a alteraciones artificiales en el comportamiento migratorio de leucocitos, alteración de la oxigenación del hígado y, por tanto, un mayor daño del hígado, que afecta a la respuesta inmune del hígado, así como la preservación de órganos y el tiempo de vida general del animal.
Los primeros estudios microscópicos se basaron en mi epifluorescencia intravitalesmicroscopia, pero varias limitaciones técnicas tales como blanqueo foto y poca profundidad de penetración limitan el uso de esta técnica para obtener imágenes del hígado a largo plazo 4,11,12. Con el desarrollo de la microscopía multifotónica en la década de 1990, las limitaciones de blanqueo foto o profundidad de penetración se resolvieron principalmente, ya que este nuevo método es técnicamente capaz de realizar estudios de imagen en prácticamente todos los órganos en virtud de situaciones de la vida real 13-15. Sin embargo, los principales desafíos pendientes con respecto a las imágenes del hígado fueron: los movimientos de la respiración, la autofluorescencia del tejido hepático, que aseguran el flujo de sangre sin alteraciones en los sinusoides hepáticos, y proyección de imagen especialmente estables durante periodos de varias horas 16 más.
Aunque varios estudios abordaron la función y la migración de diversos leucocitos en el hígado 17, por ejemplo, la NKT-18-20 células, células T 21,22, los macrófagos del hígado 23,24 o neutrófilos 25, a largo plazo multifotónica mimágenes icroscopy aún no se había establecido con éxito, una tarea aún más difícil en los animales con enfermedad hepática aguda o crónica debido a los daños existentes y, por tanto, una mayor susceptibilidad a daños mayores 26. Sin embargo, el monitoreo del comportamiento migratorio y la función celular de los leucocitos en el hígado en tiempo real permite a los nuevos conocimientos en su papel particular en la homeostasis del hígado y la enfermedad 27.
El CXCR6 receptor de quimioquinas se expresa en varios subgrupos de linfocitos, incluyendo las células asesinas naturales (NK), las células NKT y algunas poblaciones de células T 18,28. Estudios previos en ratones han indicado que CXCR6 y su CXCL16 ligando afín pueden controlar el patrullaje de las células NKT en sinusoides hepáticos durante la homeostasis. En consecuencia, el uso de ratones CXCR6.gfp (que lleva un knock-in de la proteína fluorescente verde [GFP] en el locus CXCR6) se ha descrito para investigar la migración de linfocitos en diversos órganos tales como el cerebro 29y también el hígado 18,20, mostrando aumento de la infiltración de células CXCR6.gfp sobre la inflamación.
Con el método proporcionado en este estudio era posible seguir estos procesos durante un largo período de tiempo en condiciones estabilizadas. El procedimiento basado multifotónica intravital permitió imagen que era altamente reproducible con perturbación mínima del animal y el órgano; optimizado para la supervivencia de los animales a largo plazo por una extensa evaluación que sigue un estricto control de la respiración y la circulación; y altamente flexible y fácil de adoptar también a otros órganos parenquimatosos como el riñón o el bazo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El objetivo de nuestro estudio fue desarrollar un método altamente estandarizada, estable y reproducible para la imagen TPLSM intravital del hígado. Intravital de imágenes en general ha dado información valiosa sobre el comportamiento celular en condiciones reales siguientes vivienda y la interacción de las diferentes poblaciones de leucocitos en el desarrollo, la homeostasis y la enfermedad. Sin embargo, la posición anatómica algo difícil del hígado, debido a que las vías respiratorias y el movimiento intesti…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Central Animal facility of the University Hospital Aachen for technical support. This work was supported by the German Research Foundation (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) and by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen. This work was further supported by the Core Facility ”Two-Photon Imaging”, a Core Facility of the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen within the Faculty of Medicine at RWTH Aachen University.
Materials
| Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Fentanyl | Rotex Medica | charge: 30819 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| Glucose 5% | Braun | ||
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ketamin 10% | ceva | Charge: 36217/09 | |
| Xylazin 2% | medistar | Charge: 04-03-9338/23 | |
| Consumable supplies | |||
| 20ml Syringe | BD Plastipak | ||
| 250ml Erlenmeyer flask | Schott Duran | 21 226 36 | |
| 25mL Beaker 2x | Schott Duran | 50-1150 | |
| 2ml syringe | BD Plastipak | ||
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V7980 | |
| Agarose | commercially available | ||
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit | Fine Science Tools Inc. | 18010-00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Cover Slip 24x50mm | ROTH | 1871 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Feather disposable scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Fine Bore Polythene Tubing 0,58mm ID | Smiths medical | 800/100/200 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | 5x 0,5ml |
| Leukoplast | BSN Medical Inc. | ||
| Microscope Slides | ROTH | 1879 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G x 1 | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G x 1 | B. Braun | 4657705 | |
| Tissue paper | commercially available | ||
| Surgical Instruments | |||
| Amalgam burnisher 3PL | Gatz | 0110? | |
| Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 | Storz&Klein | S-01134 | |
| Dumont No.7 forceps | Fine Science Tools Inc. | 91197-00 | |
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight x2 | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Heidemann spatula HD2 | Stoma | 2030.00 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| ECG Trigger Unit | Rapid Biomedical | 3000003686 | |
| MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer | AD Instruments | ||
| Minivent Typ 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
| Multiphoton microscope Trimscope I | LaVision | ||
| Perfusor Compact | B. Braun | ||
| PowerLab 8/30 8 channel recorder | AD Instruments | PL3508 | |
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Temperature sensor | comercially available | ||
| Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box | Life Imaging Services |
References
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