ह्यूमन इम्यूनो वायरस की प्रतिकृति स्वास्थ्य निर्धारण के लिए जोड़ो में ग्रोथ प्रतियोगिता परख
Summary
Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.
Abstract
In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.
Introduction
वायरल प्रतिकृति फिटनेस एक दिया पर्यावरण 1 में संक्रामक संतान का उत्पादन करने के लिए एक वायरस की क्षमता के रूप में परिभाषित किया गया है और समय पर 2 जनसंख्या के स्तर पर एक वायरस संस्करण की व्यापकता का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण योगदान कारक है। इन विवो के रूप में फिटनेस पढ़ाई ऐसे एचआईवी -1 के रूप में रोगजनक मानव वायरस, विभिन्न इन विट्रो में और साथ संभव नहीं हैं पूर्व vivo प्रतिकृति फिटनेस assays के दवा प्रतिरोध और प्रतिरक्षा बच म्यूटेशन, एपिस्टासिस और विकास से उत्पन्न होने वाले फिटनेस पर प्रभाव का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है के वायरल आबादी 3-6। अलग फिटनेस assays के अलावा, विकास प्रतियोगिता assays के विवो 1,7,8 में होता है के रूप में दो या दो से अधिक वायरल वेरिएंट, ठीक उसी पर्यावरणीय परिस्थितियों के तहत एक ही सेल की आबादी के लिए प्रतिस्पर्धा के रूप में, फिटनेस मतभेदों के अधिक संवेदनशील और वैध उपायों उपज के लिए पहचाने जाते हैं। विकास प्रतियोगिता प्रयोगों शुरू, कई variab पहलेलेस संक्रमण के विभिन्न multiplicities (MOI), वायरल इनपुट अनुपात, और विश्लेषण के लिए नमूने के समय के उपयोग सहित निर्धारित करने की आवश्यकता है। हम वायरल विकास कैनेटीक्स पर और प्रतियोगिता के प्रयोगों के परिणाम पर इन मानकों के प्रभाव का अध्ययन किया है, और सेल संस्कृति 9 में एचआईवी -1 फिटनेस के मजबूत मापन के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण कारकों की पहचान की है।
परख चर के अलावा, विकास प्रतियोगिता प्रयोगों में वायरल वेरिएंट quantitating लिए तरीकों की एक किस्म है। 10,11 थोक या प्रतिरूप अनुक्रमण 12,13 ब्याज की साइट (ओं) पर न्यूक्लियोटाइड आवृत्तियों के आधार पर प्रतिस्पर्धा वायरस के अनुपात का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। सापेक्ष फिटनेस समय के साथ इस अनुपात में बदलाव से ली गई है। डीएनए अनुक्रमण सेवाओं को व्यापक रूप से उपलब्ध हैं के रूप में इस विधि सुविधाजनक है। समानांतर एलील विशिष्ट अनुक्रमण (पास) विधि कई स्थलों पर अनुक्रमण और रिकोम्बिनेंट्स 14 का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है </sup>, लेकिन यह भी विशेष रूप से विकसित अभिकर्मकों और पता लगाने प्रणालियों की आवश्यकता है। अनिवार्य रूप से, इन तरीकों में ब्याज की एक क्षेत्र में न्यूक्लियोटाइड मतभेद की एक छोटी संख्या के साथ वायरल उपभेदों अध्ययन करने के लिए विकसित किए गए। अन्य तरीकों के लिए एक छोटा सा पत्रकार जीन अनुक्रमण द्वारा प्रतिस्पर्धा वायरस, heteroduplex पर नज़र रखने के assays के (एचटीए) 4,7,17,19 भेद या प्रतिलेखन मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन को उल्टा करने के टैग के रूप में 15 या पर्याय म्यूटेशन 4,16-18 का उपयोग की परवाह किए बिना अनुक्रम समानता के तनाव प्रतिस्पर्धा अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है जो सभी के लिए (आर टी-qPCR) 15,16,18,20,। एक अतिरिक्त कदम वायरल जीनोम में टैग को पेश करने की जरूरत है और आर टी-qPCR परख भी विशिष्ट अभिकर्मकों और इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता है। हमने पाया है कि थोक सेंगर अनुक्रमण पैदावार तुलनीय परिणाम 9।
विकास प्रतियोगिता के बाद, वायरल प्रतिकृति फिटनेस रिश्तेदार रखरखाव, या टी के बीच एक फिटनेस अनुपात के रूप में प्रस्तुत किया जाता हैवायरल वेरिएंट wo। एक वायरस के रिश्तेदार फिटनेस inoculum में अपनी प्रारंभिक अनुपात द्वारा या दो प्रतिस्पर्धा वायरस के बीच शुद्ध वृद्धि दर अंतर के रूप में सामान्यीकृत एक वायरल संस्करण के अंतिम अनुपात के रूप में परिभाषित किया जा सकता है। हम बाद विधि, केवल घातीय वृद्धि चरण के भीतर अनुदैर्ध्य डेटा बिंदुओं का उपयोग करते हुए, सबसे मजबूत परिणाम 9,20 उत्पादन किया है कि पाया।
इन विट्रो में फिटनेस assays के जैविक क्लोन 6-8 और एचआईवी -1 के संक्रामक आणविक क्लोन अध्ययन करने के लिए मुख्य रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं। उत्तरार्द्ध, आनुवंशिक हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी जा रहा है, अक्सर विशेष म्यूटेशन या ब्याज 3-5,21,22 के विशिष्ट दृश्यों से फिटनेस पर प्रभाव का अध्ययन करने के लिए कार्यरत हैं। निम्नलिखित प्रोटोकॉल वायरल विकास कैनेटीक्स, एक दृश्य टैग युक्त एचआईवी -1 वैक्टर का उपयोग नए पूर्ण लंबाई संक्रामक एचआईवी -1 आणविक क्लोन के निर्माण के हित के म्यूटेशन को शुरू करने, वायरल शेयरों बनाने और स्थापित करने की बात से एक कार्यप्रवाह का वर्णनरिश्तेदार फिटनेस विकास प्रतियोगिता परख प्रदर्शन और गणना करने के लिए (चित्रा 1)।
हमारे अनुकूलित प्रक्रियाओं का उपयोग करना, हम तीन पुनः संयोजक एचआईवी -1 म्यूटेंट बनाया है और उनकी प्रतिकृति फिटनेस निर्धारित की। पुनः संयोजक आणविक क्लोन पहले एक कृत्रिम COTB (केंद्र के- साथ, pNL4-3, एचआईवी -1 प्रयोगशाला तनाव NL4-3 की एक पूरी लंबाई की संक्रामक जीनोम युक्त प्लाज्मिड की एचआईवी -1 ढकोसला-पी 24 जीन क्षेत्र की जगह से निर्माण किया गया था ट्री, उप-प्रकार बी) ढकोसला-पी 24 अनुक्रम 23 प्रोटोटाइप तनाव पैदा करने के लिए। एकल एमिनो परिवर्तन (T186M, T242N, और I256V) तो तीन उत्परिवर्ती क्लोन बनाने के लिए शुरू किए गए थे। प्रत्येक उत्परिवर्ती दिया आनुवंशिक पृष्ठभूमि में प्रत्येक उत्परिवर्तन की फिटनेस प्रभाव का निरीक्षण करने के प्रोटोटाइप वायरस के खिलाफ प्रतिस्पर्धा की गई थी। तीन म्यूटेंट प्रोटोटाइप वायरस की तुलना में मामूली काफी कम से प्रतिकृति fsitness का स्तर अलग प्रदर्शन किया। T242N उत्परिवर्तन पहले से एक उदारवादी fitne होने की भी सूचनाएसएस इस अध्ययन में दिखाया गया है परिणाम के समान 24-26, लागत। अन्य दो म्यूटेशन की फिटनेस लागत पहले से नहीं बताया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
पुनः संयोजक एचआईवी -1 आणविक क्लोन और विकास प्रतियोगिता assays के निर्माण: प्रस्तुत प्रोटोकॉल दो मुख्य भागों शामिल थे। एक dually संक्रमित कोशिका संस्कृति में दो वायरस भेद करने के लिए आदेश में यह प्रतिस्पर्धा आणविक क्लोन एक आर टी-qPCR प्राइमर जांच परख द्वारा या सेंगर अनुक्रमण से पता लगाया जा सकता है जो अनुक्रम टैग, कि रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल एचआईवी -1 NL4-3 VIF के एक ही क्षेत्र पर कब्जा है और एक ही अमीनो एसिड अनुक्रम सांकेतिक शब्दों में बदलना, लेकिन छह पर्याय म्यूटेशन से भिन्न होते हैं जो VifA और VifB टैग, का उपयोग करता है। ये परिवर्तन को प्रभावित नहीं दिखाया गया वायरल प्रतिकृति फिटनेस 20। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल पीसीआर आधारित क्लोनिंग विधि प्रतिबंध साइट आधारित क्लोनिंग की तुलना में, क्लोनिंग साइटों के चयन में और अधिक लचीलापन प्रदान करता है। हालांकि, पीसीआर क्लोनिंग की दक्षता में डालने का आकार बढ़ता है के रूप में कम हो जाती है। डालने के आकार की वर्तमान सीमा ~ 5 KB 34 है। पीसीआर आधारित क्लोनिंग और साइट का निर्देश mutagenesi के लिएएस, एक उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ के उपयोग के अतिरिक्त परिवर्तन की संभावना को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। उत्पादों की पर्याप्त मात्रा में उपज के लिए आवश्यक पीसीआर चक्र की न्यूनतम संख्या का उपयोग भी सिफारिश की है। हमारे अनुभव में, हम यहाँ वर्णित पीसीआर आधारित क्लोनिंग और साइट निर्देशित mutagenesis के कदम के बाद किसी भी अतिरिक्त म्यूटेशन का पता नहीं चला। फिर भी पीसीआर उत्पादों को किसी भी अवांछित परिवर्तन के लिए जाँच करने के लिए अनुक्रम किया जाना चाहिए। आदर्श रूप में, पूरे एचआईवी कोडिंग क्षेत्र resequenced किया जाना चाहिए।
कम से कम तीन नमूने समय अंक घातीय वृद्धि चरण 9 के भीतर जांच की जानी चाहिए। वायरल विकास कैनेटीक्स पहले विकास प्रतियोगिता के लिए उपयुक्त संस्कृति अवधि और नमूने समय अंक निर्धारित करने के लिए दैनिक नमूने का उपयोग कर स्थापित किया जाना चाहिए। वायरल विकास कैनेटीक्स को प्रभावित करता है एक पहलू है कि संक्रमण (MOI) की बहुलता है। इसे और अधिक भूमिका की उपज के लिए दिखाया गया था के रूप में यह प्रोटोकॉल, monoinfection और विकास प्रतियोगिता दोनों के लिए 0,005 की कुल MOI का उपयोग करता हैकम MOIS 9 से प्रतिमा का परिणाम है। बहरहाल, कम MOIS यदि आवश्यक हो तो एक लंबी घातीय वृद्धि चरण प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन परिणाम स्थिरता की कीमत पर किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के वायरस की फिटनेस मतभेद पहले से आम तौर पर अज्ञात हैं यह सोचते हैं कि 50:50 के एक प्रारंभिक संक्रमण अनुपात से पता चलता है। वायरल प्रतिकृति कैनेटीक्स में महत्वपूर्ण मतभेद का सुझाव प्रारंभिक आंकड़ों है जब वहाँ हालांकि, असमान इनपुट अनुपात के उपयोग के लिए उपयुक्त हैं। इन मामलों में, 70:30 के एक संक्रमण अनुपात कम फिट वायरस अतिरिक्त 9 में रखा गया है, जहां एक बड़ी फिटनेस अंतर का पता लगाने के लिए अनुमति देने के लिए सिफारिश की है।
वायरल विकास कैनेटीक्स, और एचआईवी -1 उप-प्रकार बी का उपयोग कर प्रतियोगिता assays के अनुकूलित किया गया विकास का प्रदर्शन करने के लिए TCID 50 का निर्धारण करने के लिए प्रोटोकॉल, जिसका PBMC एक एकल दाता से NL4-3 COTB-पी 24, और PBMCs एचआईवी के लिए लगातार संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया है इन विट्रो में 1 संक्रमण। संस्कृति अवधिऔर इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत नमूने समय अंक मानव PBMCs में एचआईवी -1 ग्रुप एम वायरस के अध्ययन के लिए उपयुक्त होने की संभावना है। एक ही स्रोत से PBMCs का प्रयोग अत्यधिक वायरल प्रतिकृति अलग दाता कोशिकाओं 35 में अलग-अलग हो सकता है के रूप में अनुरूप परिणाम प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है। एक प्रतिस्थापन एक ही पूल सभी प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाता है कि प्रदान के रूप में कम वांछनीय हालांकि, कई दाताओं से जमा PBMCs इस्तेमाल किया जा सकता है। एक अन्य विकल्प सेल लाइनों का उपयोग है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल टी सेल लाइन CEMx174 23,36 के साथ सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया था। हालांकि, यह वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या फिर से अनुकूलित लगातार सेल के विकास को प्राप्त करने के लिए कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है। यह वृद्धि प्रतियोगिता चरणों में उपयुक्त नमूने समय अंक निर्धारित करने के लिए, विभिन्न सेल लाइनों में भिन्नता होने की संभावना है के रूप में वायरल विकास कैनेटीक्स भी, फिर से स्थापित किया जाना चाहिए।
फिटनेस की गणना के लिए वायरल अनुपात निर्धारित करने के लिए दो अलग अलग तरीकों protoc में शामिल किए गए हैंराजभाषा। पहले प्रत्येक नमूने समय बिंदु पर वायरल सीडीएनए प्रतिलिपि संख्या को मापने के लिए आर टी-qPCR का उपयोग करता है। वायरल प्रतिकृति फिटनेस तो सीडीएनए प्रतिलिपि संख्या के आधार पर, वायरल अनुपात से गणना की गई। वैकल्पिक रूप से, वायरल अनुपात VifAB टैग स्थलों पर वर्णलेख शिखर ऊंचाई के अनुपात के आधार पर निर्धारित किया जा सकता है। दो तरीकों तुलनीय परिणाम (चित्रा 4) मिले। वर्णलेख शिखर ऊंचाई विधि एक इंजीनियर अनुक्रम टैग के बिना अन्य एचआईवी -1 उपभेदों के लिए लागू किया जा सकता है। आर टी-qPCR, वायरल वेरिएंट भेद करने के लिए प्राइमरों या जांच के उपयोग के पहले सावधानी से मूल्यांकन किया जाना चाहिए के लिए (20 देखें)। फिर भी, आर टी-qPCR के इस तरह के घातीय वृद्धि चरण के भीतर पहली बार बात से उन के रूप में वायरल शाही सेना की एक छोटी राशि के साथ नमूने के लिए बेहतर संवेदनशीलता प्रदान करता है। वायरल सीडीएनए के प्रत्यक्ष माप भी शाही सेना निकासी और सीडीएनए संश्लेषण से उत्पन्न हो सकती है कि तकनीकी समस्याओं का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। अनुक्रम टैग के साथ आणविक क्लोन का उपयोग करते हुए एक लागत प्रभावी समाधान टी प्रदान करता हैआर टी-qPCR के तरीकों के ओ, के रूप में प्राइमरों और जांच के केवल दो जोड़े कई वायरस का अध्ययन करने की जरूरत है। यह रणनीति भी अनुक्रमण अध्ययन में सभी वायरस को भर में एक ही साइट पर किया जाता है के रूप में अनुक्रम में चोटी ऊंचाई बदलाव की समस्या, पड़ोसी ठिकानों 37 की वजह से chromatograms से बचा जाता है। आर टी-qPCR और सेंगर अनुक्रमण के लिए उत्पादित पीसीआर उत्पादों को भी अन्य तरीकों के साथ उपयोग के लिए ऐसे व्यक्ति क्लोन 12,13 के थोक अनुक्रमण, एचटीए 4,7,17,19, या oligonucleotide बंधाव परख (ओला) 38 के रूप में वायरल अनुपात निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है ।
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These studies were funded by US Public Health Services grants P01AI057005, R01AI047734, R01AI111806 and the Functional Profiling and Computational Biology Core of the University of Washington’s Center for AIDS Research (P30 AI027757).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Construction of recombinant clones | |||
| Chimeric primer/Mutagenic/Sequencing primers | IDT | N/A | Custom DNA oligos |
| pNL4-3VifA and pNL4-3VifB plasmid | N/A | N/A | Please contact Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu) |
| High-Fidelity DNA polymerase | Thermo Scientific | F-549S | |
| High-fidelity buffer | Thermo Scientific | F-549S | |
| dNTP | Bioline | Bio-39026 | |
| Thermal cycler | Life Technologies | N/A | Applied Biosystems® GeneAmp® PCR System 9700 |
| DNA loading dye | Thermo Scientific | R0631 | |
| 1kb Plus DNA ladder | Invitrogen | 10787-018 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| DpnI enzyme | New England Biolabs | R0176S | |
| TOP10 chemically competent Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
| Luria Broth base powder | Invitrogen | 12795-084 | |
| Carbenicillin | Research Products International | C46000-25.0 | |
| QIAprep Spin Miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Transfection | |||
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 6365787001 | |
| HEK 293T-17 | ATCC | CRL-11268 | http://www.atcc.org/ |
| 0.22um filter top tube | VWR International | 89220-716 | |
| Cell culture | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566016 | |
| Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium (IMDM) | Life Technologies | 31980-030 | |
| RPMI-1640 media | Life Technologies | 61870-036 | |
| Phytohemagglutinin (PHA) | Thermo Scientific | R30852801 | |
| Human Interleukin-2 | Roche | 11147528001 | |
| Fetal bovine serum | JR Scientific | 43640 | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning Cellgro | 30-001-CI | |
| 6 well plate | VWR Scientific | 73520-906 | |
| 48 well plate | VWR Scientific | 62407-338 | |
| 96 well flat-bottomed plate | ISC Bioexpress | T-3015-4 | |
| 96 well round-bottomed plate | BD Falcon | 353077 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | Mt. Baker Bio | MBD-1500 | |
| 1.5 mL tubes w/ O-ring | VWR Scientific | 89004-290 | |
| 50 mL conical tube | ISC Bioexpress | C-3317-6 | |
| ELISA | |||
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Invitrogen | 14190-250 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0392 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Rabbit anti-HIV-1 SF2 p24 antiserum | NIH AIDS Reagent Program | 4250 | |
| Goat anti-rabbit HRP | KPL | 474-1516 | |
| TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 52-00-01 | |
| H2SO4 | Fisher Scientific | A300-500 | Causes severe burns by all exposure routes. Use personal protective equipment. Use only under a chemical fume hood. Wash off immediately with plenty of water for at least 15 minutes. |
| HIV p24 standard | AIDS and Cancer Virus program (NCI-Frederick) | N/A | For order details please contact Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov); http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx |
| Microplate reader | Molecular Devices | N/A | VMax Kinetic ELISA Microplate Reader |
| RNA isolation cDNA synthesis | |||
| QIAxtractor | Qiagen | N/A | http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52906 | |
| dNTP | Bioline | Bio-39026 | |
| SuperscriptIII | Invitrogen | 18080-085 | |
| First-strand buffer | Invitrogen | 18080-085 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Invitrogen | 18080-085 | |
| Rnase inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| RnaseH | Invitrogen | 18021-071 | |
| qPCR | |||
| Real-time qPCR machine | Life Technologies | N/A | Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR |
| TaqMan® Gene Expression Master Mix | Life Technologies | 4369016 | |
| Forward, reverse primer | IDT | N/A | Custom order |
| Probe | Life Technologies | N/A | Custom order |
| optical 96 well reaction plate | Life Technologies | I19N3Q216 | |
| PCR+sequencing | |||
| Taq DNA polymerase (Biolase) | Bioline | Bio-21043 | |
| NH4 buffer | Bioline | Bio-21043 | |
| MgCl2 | Bioline | Bio-21043 | |
| Sequencing primer | IDT | N/A | Custom order |
| QIAxcel | Qiagen | http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system | |
| DNA sequencing service provider | http://www.htseq.org/ | ||
| GRC web tool | http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ | ||
| ChromatQuan web tool | http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi |
References
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