멀티 모달 분자 이미징 애플리케이션을위한 Biofunctionalized 프 러시안 블루 나노 입자
Summary
This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.
Abstract
다 모드는, 분자 영상은 여러 상보 이미징 기술을 사용하여, 세포 내 세포 및 분자 수준의 해상도에서의 생물학적 과정을 시각화한다. 이들 조영제 모두 진단 및 치료 효능을 향상 생체 내 경로 및 메커니즘의 실시간 평가를 용이하게한다. 복합 분자 이미징 응용 프로그램에서 사용할 에이전트의 새로운 클래스 -이 문서 biofunctionalized 감청 나노 입자의 합성 (PB 된 NP)에 대한 프로토콜을 제시한다. 나노 입자, 형광 이미징 및 자기 공명 영상 (MRI)에 포함되는 영상 방식이 보완 기능을 갖는다. PB NPS는 가돌리늄, 망간 이온이 T 1 및 T 2 -weighted 서열 모두에서 PB 격자의 격자 간 공간 내에 통합 MRI 콘트라스트를 생성하는 코어 – 쉘 디자인을 갖는다. PB NP에 정전 사용하여 형광 아비딘으로 코팅 자체를-로형광 이미징을 가능하게 sembly. 아비딘 – 코팅 된 나노 입자는 나노 입자에 대한 분자 표적으로 기능을 부여 바이오틴 리간드로 변형된다. 나노 입자의 안정성과 독성은 자신의 MRI의 relaxivities뿐만 아니라, 측정된다. 이러한 NP는 biofunctionalized PB의 복합 분자 이미징 기능이어서 형광 이미징 및 MRI 분자 체외에서 그들을 사용하여 증명된다.
Introduction
분자 영상은 세포, 세포 내에서의 생물학적 과정, 및 분자 수준 1의 비 침습성 시각화 및 타겟이다. 분자 영상은 내인성 경로 및 메커니즘은 실시간으로 평가하는 동안 네이티브 미세 환경에 남아 시험편을 허용한다. 일반적으로, 분자 영상은이 검토되고, 구상 대상과 관련된 생리 학적 과정을 추적하는 작은 분자, 거대 분자, 또는 나노 입자의 형태로 촬상 외인성 제제의 투여를 포함한다. 분자 영상에서 탐구 된 다양한 영상 방식은 MRI, CT, PET, SPECT, 초음파, photoacoustics, 라만 분광법, 생물 발광, 형광 및 생체 내에 현미경 (3)를 포함한다. 조영이 조합 시각화하고 다양한 생물학적 과정과 이벤트를 특징 짓는 네 능력을 향상 둘 이상의 영상 방식의 조합이다. Multimoda각자의 한계를 보상하면서 3 L 이미징, 개별 이미징 기술의 장점을 이용한다.
멀티 모드, 분자 이미징 에이전트의 새로운 클래스 -이 문서 biofunctionalized 감청 나노 입자의 합성 (PB 된 NP)에 대한 프로토콜을 제시한다. PB 국민 연금 형광 이미징 및 분자 MRI를 위해 사용된다. PB는 면심 입방 네트워크에서 철 (II), 철 (III) 원자를 교대로 이루어진 안료 (도 1)이다. CN – – 그 삼차원 네트워크 (5) 내에서 전하 균형 양이온을 포함 철 III 링키지 PB 격자는 철 시안화물 II의 선형 리간드로 구성된다. 그 격자에 양이온을 통합하는 PB의 능력은 별도로 MRI 대비를위한 PB 된 NP에 가돌리늄, 망간 이온을로드하여 이용된다.
MRI 대비를위한 나노 입자 디자인을 추구하기위한 이론적 근거 때문에이다이 디자인의 장점은 현재의 MRI 조영제에 대해 제공한다. US FDA 승인 MRI 조영제의 대부분은 자연에서 상자성이고 스핀 – 격자 완화기구 6,7,8 의해 포지티브 대조를 가돌리늄 킬레이트이다. 그 자체로 낮은 신호 강도를 제공하는 단일 가돌리늄 킬레이트 비교해서 나노 입자의 PB 격자 내의 여러 가돌리늄 이온의 혼입은 신호 강도 (양 대비) 3,9- 더욱 향상. 또한, PB 격자 내의 여러 가돌리늄 이온이 존재함으로써, 스핀 – 스핀 완화기구에 의해 음의 콘트라스트를 생성하는 전체적인 스핀 밀도와 그 근방에있는 로컬 자기장 교란 나노 입자의 상자성의 크기를 증가시킨다. 따라서 가돌리늄 함유 나노 입자는 T (긍정적 인) 1과 T 2 (음) 조영제 (10, 11) 모두로 작동합니다.
신장 기능이 손상된 환자의 일부에서, 가돌리늄 계 조영제의 투여가 신원 성 전신 섬유증 8,12, (13)의 발전에 연결되었다. 이러한 결과는 조영제로서 대안 상자성 이온의 사용으로 조사를 묻는 메시지가있다 MRI. 따라서, 나노 입자의 다목적 설계 PB 격자 내에 망간 이온을 포함하도록 구성된다. 가돌리늄 킬레이트와 마찬가지로, 망간은 상자성 킬레이트 및 일반적 MRI 7,14 양성 신호 강도를 제공하기 위해 사용된다. 가돌리늄 – 함유 PB 된 NP와 같이, 망간 함유 PB NPS는 또한 (포지티브) T 1 및 T 2 (네거티브) 조영제로서 기능.
형광 이미징 기능을 통합하기 위해, 나노 입자 "코어"형광 표지 된 아비딘 당 단백질로 이루어진 "biofunctional"쉘 (도 1로 코팅). 아비딘 아니라 형광 이미징을 가능하게 할뿐만 아니라 특정 세포 및 조직을 대상으로 바이오틴 리간드 도킹 플랫폼의 역할을한다. 아비딘 – 바이오틴 결합은 비오틴과 아비딘 (15) 사이에 매우 강한 결합 친화도를 특징 강한 알려진, 비 – 공유 결합이다. 아비딘 코팅 PB 국민 연금 바이오틴 리간드의 첨부 파일 PB 국민 연금 분자 타겟팅 기능을 부여한다.
이러한 이미징을 보완 기능을 가지고 있기 때문에 PB NPS를 사용하여 형광 및 MR 영상을 추구 동기입니다. 형광 이미징은 가장 널리 사용되는 광 분자 이미징 기술 중 하나이며, 고감도 1,16,17 여러 오브젝트의 시각화를 동시에 허용한다. 형광 이미징은 안전한, 비 침습적 양상이지만 낮은 침투 깊이와 공간 해상도 1,3,16와 연관된다. 한편, MRI 높은 시간적 생성D 공간 해상도 비 침습적 방사선 1,3,16 이온화를위한 필요없이. 그러나 MRI는 낮은 민감도 겪고있다. 따라서 형광 이미징 및 MRI 인해 깊이 침투, 감도 및 공간 해상도의 상호 보완 기능을 분자 영상 기술로 선정되었다.
이 문서에서는 PB 된 NP의 합성 및 biofunctionalization에 대한 프로토콜을 제시, 가돌리늄 함유 PB 된 NP (GdPB), 및 망간 함유 PB 된 NP (MnPB) 10, 11을. 다음과 같은 방법이 설명되어 있습니다 : 1) 크기, 비용의 측정, 나노 입자의 시간적 안정성, MRI의 relaxivities 3) 측정 나노 입자의 세포 독성 2) 평가, 형광 분자 자기 공명 영상을위한 나노 입자의 4) 활용 체외에서 대상 세포의 인구. 이러한 결과들은 생체 내에서 멀티 모달, 분자 영상 화제로서 사용 된 NP의 가능성을 입증한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서 biofunctionalized 프 러시안 블루 (Prussian blue) 나노 입자를 기반으로 복합, 분자 이미징 에이전트의 새로운 클래스의 합성 방법을 제시하고있다. 나노 입자에 통합 분자 영상 방식으로 인해 상호 보완 기능으로, 형광 이미징 및 분자 MRI 있습니다. biofunctionalized 감청 된 나노 입자는 코어 – 쉘 디자인을 가지고있다. 이들 나노 입자의 합성은 핵심 단계 : 1) 한 냄비 감청 나노 입자로 구성되어 코어…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation (RAC Awards #30000174 and 30001489).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6 · 3H2O) | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2 · 4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3 · 6H2O) | Sigma-Aldrich | 211591 | |
| Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3 · 6H2O) | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody | Millipore | AB5320 | |
| Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3 | Peprotech | 500-P156GBT | |
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| BSG D10 Cell Line | Lab stock | — | |
| OE21 Cell Line | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| SUDIPG1 Neurospheres | Lab stock | — | |
| Eol-1 Cell Line | Sigma-Aldrich | 94042252 | |
| Poly(L-lysine) hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1399 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Aminoactinomycin D | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange, AM | Life Technologies | C34851 | |
| Avidin-Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21370 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Peristaltic Pump | Instech | P270 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | |
| Sonicator | QSonica | Q125 | |
| Hot Plate/Magnetic Stirrer | VWR | 97042-642 | |
| Ultra Clean Aluminum Foil | VWR | 89107-732 | |
| Vortex Mixer | VWR | 58816-121 | |
| 1.7 mL conical microcentrifuge tubes | VWR | 87003-295 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | VWR | 21008-918 | |
| Tube holders | VWR | 82024-342 | |
| Disposable plastic cuvettes | VWR | 7000-590 (/586) | |
| Zetasizer capillary cell | VWR | DTS1070 | |
| Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin column | VWR | 82031-356 | |
| 96-well cell culture tray | VWR | 29442-056 | |
| Trypsin EDTA 0.25% solution 1X | JR Scientific | 82702 | |
| Cell Culture Grade PBS (1X) | Life Technologies | 10010023 | |
| XTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4891-025-K | |
| T75 Flask | 89092-700 | VWR | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowhitaker | 12-604Q | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-010 | |
| Pen-Strep 1X | Life Technologies | 15070063 | |
| Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1200 | |
| Chambered Microscope Slides | Thermo Scientific | 154534 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| RPMI | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| 3 T Clinical MRI Magnet | GE Healthcare | ||
| 100 mL round-bottom flask |
References
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