LepR<sup> Db</sup> Mouse Model van Type 2 Diabetes: eilandjes van Langerhans Isolatie en live-cell 2-Photon Imaging van intacte Eilandjes
Summary
We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.
Abstract
Type 2 diabetes is een chronische ziekte die 382 miljoen mensen in 2013, en zal naar verwachting 592 miljoen stijgen met 2035 1. In de afgelopen 2 decennia, de rol van de beta-cel disfunctie bij type 2 diabetes is duidelijk vastgesteld 2. Onderzoek vooruitgang vereist voor de isolering van pancreaseilandjes. Het protocol van het eilandje isolatie gepresenteerde heeft veel gemeen stappen protocollen van andere groepen, met enkele wijzigingen om de opbrengst en kwaliteit van geïsoleerde eilandjes van zowel het wildtype en diabetische db LepR (db / db) muizen. Een levende cel 2-photon beeldvormingsmethode Vervolgens krijgt die gebruikt kan worden om de besturing van insulineafscheiding in eilandjes onderzoeken.
Introduction
De rol van de beta-cel disfunctie bij de ziekte is algemeen erkend 3,4. Cellijnen zoals MIN6 en INS-1 zijn nuttige hulpmiddelen om de biologie van beta cel gedrag te begrijpen. De fysiologische sturing van insulinesecretie vindt plaats in de eilandjes van Langerhans. Deze eilandjes bevatten duizenden dicht opeengepakte beta-cellen, alsmede bloedvaten en andere endocrine celsoorten. Deze omgeving binnen het eilandje invloed insulinesecretie en kan waarschijnlijk bij diabetes zijn. Daarom, om de fysiologische controle van insulinesecretie en de pathofysiologie van de ziekte te begrijpen, is het essentieel intacte eilandjes bestuderen.
Isolatie Islet
Levende menselijke eilandjes en in het bijzonder menselijke eilandjes aan type 2 diabetes patiënten moeilijk te verkrijgen. Bovendien humane eilandjes hebben beperkte mogelijkheden voor experimentele moleculaire manipulatie. Onderzoekers hebben daarom in dienst istermijn van dieren en dierlijke modellen van type 2 diabetes. Een dergelijke ziekte model is de db / db muis. Dit is een mutatie die spontane modellen Type 2 diabetes met een fenotype progressie die parallel loopt met menselijke ziekten 5,6. De hier gepresenteerde voor eilandje isolatie van diabetische db / db-muizen protocol vele trappen evenals andere groepen met een aantal verfijningen voor betere opbrengst, reiniging en verbeterde eilandje overleving.
2 foton imaging
De live-cell 2-foton assay hier beschreven stelt onderzoekers in staat om het aantal te kwantificeren en evalueren van de kenmerken van de single-insuline met korrels van veel cellen van diabetische 7 en wild type eilandjes 8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
De belangrijkste factor bij het eilandje isolement de initiële perfusie van de pancreas; Een onder pancreas perfusie resulteert in een aanzienlijk lagere opbrengst eilandje. Andere factoren beïnvloeden ook de isolatie kwaliteit zoals destructietijd en de mate van schudden die gedeeltelijk kan compenseren voor het niveau van perfusie. Bijvoorbeeld, een volledig pancreas perfusie moeten worden geïncubeerd bij 37 ° C gedurende ~ 18 min 30 sec onder zacht schudden daarentegen een onder gedigereerd pancreas ~ 20 minuten …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Australian Research Council Grant DP110100642 (to PT) and National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 and APP1059426 (to PT and HYG).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Liberase TL 5mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10X) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1X) 500ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
References
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
- Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
- Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53, S16-S21 (2004).
- Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes. Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).
- Wang, Y. W., et al. Spontaneous type 2 diabetic rodent models. Journal of Diabetes Research. , (2013).
- Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. Diabetes a new mutation in mouse. Science. 153, 1127-1128 (1966).
- Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells. Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).
- Low, J. T., et al. Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell. Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297, 1349-1352 (2002).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2, 13 (2003).
