의 수직 이미지<em> 초파리</em> 계란 챔버
Summary
The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.
Abstract
Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.
Introduction
초파리의 연구 현상의 넓은 범위의 유전자 조절에 큰 통찰력을 제공하고 있습니다. oogenesis 티슈 패터닝 셀 극성의 변화, 세포주기 스위칭, 및 병진 규제 1,2,3,4- 등 다양한 발달 과정을 조사하기 취급 용이 한 방법을 제공하기 때문에 특히, 계란 개발에 대한 광범위한 연구가있어왔다. oogenesis 때 중요한 형태 발생 이벤트 (5 검토) 테두리 세포라는 세포의 집합의 명세서, 운동성의 취득 및 마이그레이션이다. 세포 이동하기 때문에 동물 형태 발생의 중요한 특징이며,이 프로세스의 유전자 조절이 잘 보존되어 있기 때문에, 파리 결정 메커니즘은 다른 상황에서 중요 할 것으로 보인다. 따라서, 우리는 경계 세포 이동의 분자 제어를 조사하고있다. 우리의 연구를 위해, 우리는 계란을 개발하는 전방 극을 관찰 할 수있는 새로운 방법을 개발했다,경계 셀이 발생하는 경우, 그들이 어떻게 발달 상세히 검토한다.
난소 내에서 다양한 발달 단계에서 계란 챔버는 얇은 외피 (그림 1A)에 싸여있다 ovarioles라는 체인을 따라 존재한다. 각 달걀 챔버는 한 계란을 형성에 갈 것입니다. oogenesis 동안 여러 종류의 세포 조화롭게 개발해야한다. D. 달걀 melanogaster의 챔버는 단일 모낭 상피 층 (6)에 의해 둘러싸인 하나의 난자를 포함한 16 생식계 세포로 구성된다. 극성 세포라는 특수한하는 소수의 세포는 상피의 전후방 극에서 발생한다. 6-8 테두리 세포 극성 세포에 의해 유도 된 5,7- 달걀 챔버의 전방 상피에서 발생. 중간 oogenesis (단계 9)에서, 경계 셀들이 이웃으로부터 분리하고 계란 5,7- 챔버의 후방에 도달하는 난자 세포 간호사 사이에 이동한다. 이 운동은 달성해야테두리 세포 집단이 세포 이동의 유형 만드는 두 운동성 극성 주변 세포 클러스터에 남아있다. 경계 셀 클러스터의 성공적인 마이그레이션 수정에 필요한 달걀 껍질의 micropyle의 적절한 개발을 보장합니다.
전방 극성 세포 신호 전달 캐스케이드를 활성화하여 경계 셀 운명 지시. 폴라 난자 세포의 발달 8,9 스테이지 (8) 중에 모낭 인접 셀에, 경막 수용체 Domeless (DOME)에 결합하는 사이토킨으로 독립 (UPD)를 분비한다. UPD의 결합은 야누스 티로신 키나제 (JAK)의 전사 (STAT) 8,10,11의 신호 변환기 및 활성제를 인산화됩니다. STAT는 전사를 활성화하기 위해 핵으로 이동합니다. 느린 테두리 세포 (SLBO)는 STAT의 직접 전사 대상이며, 또한 테두리 세포 이동 (12)에 요구되는 전사 인자이다. 계란 챔버의 측면보기는 t을 나타냅니다모자 STAT 활동은 전방 상피 8,11,13에 걸쳐 그라데이션으로 조절된다. 극성 세포에 가장 가까운 여포 세포 따라서 그들이 경계 셀과 인접되어 생식계 조직 침입, STAT 활성화의 가장 높은 수준을 갖는다.
국경 세포 내에서 지정 및 상피 세포에서 분리하는 방법을 이해하기 위해, 우리는 조직이 어떻게 구성되어 있는지 관찰해야합니다. 우리가 전방-에 관점에서 계란 챔버를 보면, 우리는 극성 세포를 둘러싸고있는 여포 세포에서 STAT 활동의 반경 대칭을 기대. 최종에서보기는 더 정확하게 이전에 다른 초점면에 세포를 비교하는 것보다 분리하는 동안 막 단백질과 세포 – 세포 인터페이스의 차이를 보여 것입니다. 달걀 챔버 직사각형과 줄기 세포에 의해 서로 연결되어 있기 때문에 어려운 전방 구조를 관찰하기 위해, 측 방향 슬라이드 상에 정착. 따라서, 달걀 챔버의 극의 세포에 대한 많은 정보가 있습니다측면 뷰에서 유추 된. 일부 정보는 photobleaching에 광학 부, 광 산란의 알고리즘 3-D 재구성 및 Z 축에서의 해상도 불량한 한계를 통해 얻어 질 수 있지만, 초 – 해상도 현미경 (14)과 같은 고가의 기술이없는 경우에이 정보는 이하 상세하고 신뢰성을 . 섹션 기반 이미징의 다른 종류 (예를 들어, 전자 현미경 또는 마이크로톰 절편)는 아티팩트 가능성을 증가, 탈수 포함한 조직의 광범위한 조작을 필요로한다. 따라서, 우리는 이미지 D.에 새로운 방법을 개발 똑바로 동안 melanogaster의 달걀 챔버. 이 방법은 이미 (검토중인 대표 결과와 매닝 등을 참조) 운동성이있는 세포가 운명하는 방법을 아는데 도움이 검증 된, 그리고 더 넓게 가치 oogenesis의 다른 측면의 연구 될 가능성이있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 우리는 말에 관점에서 계란 챔버를 개발, 탑재하는 방법을 설명하고 이미지 작은. 영상 계란 챔버의 일반적인 기술은 측면 플레이에 최적화 된 형광 항체 염색을 할 때 주로 메디 오 – 측면 모낭 세포의 정확한 시각화를 허용하고 있습니다. 여러 초점면을 볼 수있는 Z-스택 또는 3 차원 재구성 보조기구의 사용,하지만 여전히 타원형의 달걀 실 (그림 2D)의 극의 서브 세포 해?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We appreciate assistance from members of the fly community, particularly Dr. Denise Montell, Dr. Lynn Cooley, and Dr. Pernille Rorth, for reagents. We thank Flybase, the Bloomington Drosophila Stock Center, and Developmental Studies Hybridoma Bank for information and providing fly stocks and antibodies, respectively. LM is supported by the Department of Education Grant, Graduate Assistance in the Areas of National Need (GAANN) training fellowship (P200A120017) and by a NIGMS Initiative for Maximizing Student Development Grant (2 R25-GM55036). A portion of the microscopy work was supported by NSF MRI grant DBI-0722569 and the Keith R. Porter Core Imaging Facility. Research was supported in part by a NSF CAREER Award (1054422) and a Basil O’Connor Starter Scholar Award from the March of Dimes, both awarded to MSG.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) | Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 mo at 4°C. | ||
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | methanol-free to preserve GFP fluorescence |
| 30G x 1/2 inch needle | VWR | BD305106 | Regular bevel |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten female flies |
| Bovine Serum Albumin | PAA-cell culture company | A15-701 | Used in NP40 Wash Buffer |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich | D9542 | 5mg/ml stock solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Added to supplement dissection medium (10%) |
| Glass culture tube | VWR | 47729-576 | 14mL |
| Glass Depression Slides | VWR | 470019-020 | 1.2 mm Thick, Double Cavity |
| Glycerin Jelly | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mounting media |
| Glycerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% in PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (interchangable for Nonidet P-40) Used in NP40 Wash Buffer |
| Leica Fluorescent Stereoscope | Leica Microsystems | ||
| Leica SP5 Confocal Microscope | Leica Microsystems | 40x/0.55NA dry objective | |
| Micro spatula | VWR | 82027-518 | Stainless steel |
| Microknife | Roboz Surgical Instrument Company | 37-7546 | 45ᵒ angle |
| Microscope Slide | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Wash Buffer | 50mM TRIS-HCL, 150mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide | ||
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Life Technologies | 10378-016 | Added to supplement dissection medium (0.6X) |
| Petridish- Polysterine, sterile | VWR | 82050-548 | 60Wx15H mm |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 packs of Powder |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786-500G | Used in 0.1M KPO4 Buffer |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791-500G | Used in 0.1M KPO4 Buffer |
| Schneider’s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 |
With L-glutamine and sodium bicarbonate |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | Used in fluorescent antibody staining |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | Used in NP40 Wash Buffer |
| TRIS-HCL | IBI Scientific | IB70144 | 1M TRIS-HCL, pH 7.4 |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | For processing confocal Z-stacks |
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