Dik Görüntüleme<em> Drosophila</em> Yumurta Odaları
Summary
The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.
Abstract
Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.
Introduction
Drosophila melanogaster Çalışma olayların geniş bir genetik yönetmelik seyircilerden büyük anlayışlar sağladı. Oogenez doku desen, hücre polarite değişiklikleri, hücre döngüsü anahtarlama ve translasyonel yönetmelik 1,2,3,4 dahil olmak üzere birçok farklı gelişim süreçleri, araştırmak için bir uysal bir yol sağlar, çünkü özellikle, yumurta gelişimi üzerine kapsamlı bir araştırma olmuştur. Oogenez sırasında önemli bir morfojenik olay (5 gözden) sınır hücreleri denilen hücreler bir dizi özellikleri, motilite edinimi ve göç. Hücre göçü beri hayvan morfojenezinin önemli bir özelliğidir ve bu sürecin genetik düzenleme iyi korunduğu için, sinekler belirlenen mekanizmaları diğer bağlamlarda önemli olması muhtemeldir. Böylece, biz sınır hücre migrasyonu moleküler kontrolü araştırıyor. Bizim çalışmalar için, biz yumurta geliştirme ön direkleri gözlemlemek için yeni bir yöntem geliştirdik,Sınır hücreleri ortaya yerlerde, detaylı olarak nasıl geliştiğini incelemek için.
Yumurtalık içinde, çeşitli gelişim aşamalarında yumurta odaları ince kılıf (Şekil 1A) 'de muhafaza edilir ovarioles adı zincirleri boyunca mevcuttur. Her yumurta bir yumurta odası oluşturmak için devam edecektir. Oogenesiz sırasında, çok sayıda, farklı hücre tipleri, bir koordine bir şekilde geliştirilmesi gerekmektedir. D. melanogaster yumurta bölmesi tek katmanlı foliküler epitel 6 ile çevrili bir oosit, aşağıdakileri içeren 16 germ hat hücrelerine oluşur. Kutup hücreleri denilen özelleşmiş hücrelerin az sayıda, epitel anterior ve posterior kutuplarda ortaya çıkar. 6-8 sınır hücreleri kutup hücreleri 5,7 ile uyarılan yumurta odasının ön epiteli, köken. Orta-oogenez (evre 9), sınır hücreleri komşularından ayırmak ve yumurta odasının 5,7 olan posterior oosit ulaşmak için hemşire hücreleri arasındaki göç. Bu hareket yerine getirmesi gerekirSınır hücreleri bu kolektif hücre göçü bir tür yapma, olmayan iki hareketli kutup hücreleri çevreleyen bir kümede kalırken. Sınır hücre kümesinin Başarılı göç döllenme için gerekli olan yumurta kabuğu micropyle, düzgün gelişimini sağlar.
ön kutup hücreleri sinyal iletim dizinini aktive ederek hücre sınır kaderi talimat. Polar hücreler oosit gelişimi 8,9 aşamasında 8 sırasında folikül hücreleri komşu, bir transmembran reseptörü, Kubbesiz (DOME) bağlanan bir sitokin, eşleşmemiş (UPD), salgılarlar. UPD bağlanması Janus tirozin kinaz (JAK) transkripsiyon (STAT) 8,10,11 arasında sinyal ileticisi ve Activator fosforile olur. STAT sonra transkripsiyonu aktive etmek çekirdeğine geçer. Yavaş Sınır Hücreler (SLBO) STAT doğrudan bir transkripsiyonel hedef ve sınır hücre göçü 12 için gerekli olan bir transkripsiyon faktörüdür. Yumurta odaları Yanal manzarası t gösterirşapka STAT etkinliği ön epiteli 8,11,13 boyunca bir degrade düzenlenmiştir. Kutup hücrelere yakın folikül hücreler bu nedenle sınır hücreleri haline ve komşu germ-line doku istila, aktif STAT en yüksek seviyeleri var.
Sınır hücreleri içinde belirtilen ve epitel ayırmak nasıl anlamak için, biz doku nasıl düzenlendiğini gözlemlemek gerekir. Biz bir ön-perspektif yumurta odaları görmek, biz kutup hücreleri çevreleyen folikül hücreleri STAT aktivitesinin radyal simetri beklenebilir. Bir son bakış da daha doğru önce ve farklı odak düzlemlerinde hücreleri karşılaştırma daha Ayırma sırasında zar proteinleri ve hücre-hücre arayüzleri farklılıklar gösterir. Yumurta odaları dikdörtgen ve sap hücreleri birbirine bağlı olduğundan, onlar zor ön mimarisi gözlemlemek için yapım, yanal slaytlar üzerine yerleşmek. Böylece, yumurta odasının kutuplarda hücreler hakkında çok bilgi vardırLateral manzaralı olayla edilmiştir. Bazı bilgiler Photobleaching optik bölümlerde, ışık saçılması, algoritmik 3-D rekonstrüksiyon ve Z-ekseninde çözünürlük yoksul limitler aracılığıyla elde edilebilmesine rağmen süper çözünürlüklü mikroskopi 14 gibi pahalı tekniklerin yokluğunda bu bilgilerin daha az detaylı ve güvenilir hale . Bölüm-tabanlı görüntüleme diğer şekillerde (örneğin, elektron mikroskobu veya mikrotom kesit) eserler için olasılığını artırarak, dehidrasyon dahil dokuların, geniş manipülasyon gerektirir. Böylece, biz görüntü D. yeni bir yöntem geliştirdi dik iken melanogaster yumurta odaları. Bu yöntem zaten (inceleme altında Temsilcisi sonuçları ve Manning ve arkadaşları, bakınız) hareketli hücreler kaderde nasıl durulaştırmada yararlı kanıtlanmış ve daha geniş değerli oogenezisin diğer yönleri çalışmalarda olması muhtemeldir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada bir son perspektif yumurta odaları gelişmekte, montaj için bir yöntem tarif ve görüntü küçük. Görüntüleme yumurta odaları için ortak teknikler yanal görünümler için optimize edilmiş ve floresan antikorlar ile boyanmış zaman öncelikle iç-dış folikül hücreleri hassas görselleştirme izin vardır. Birden fazla odak düzlemleri görüntüleme Z-yığınlarının veya 3-D rekonstrüksiyonlar yardımcıları kullanımı, ama yine de eliptik yumurta odaları (Şekil 2B) kutu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We appreciate assistance from members of the fly community, particularly Dr. Denise Montell, Dr. Lynn Cooley, and Dr. Pernille Rorth, for reagents. We thank Flybase, the Bloomington Drosophila Stock Center, and Developmental Studies Hybridoma Bank for information and providing fly stocks and antibodies, respectively. LM is supported by the Department of Education Grant, Graduate Assistance in the Areas of National Need (GAANN) training fellowship (P200A120017) and by a NIGMS Initiative for Maximizing Student Development Grant (2 R25-GM55036). A portion of the microscopy work was supported by NSF MRI grant DBI-0722569 and the Keith R. Porter Core Imaging Facility. Research was supported in part by a NSF CAREER Award (1054422) and a Basil O’Connor Starter Scholar Award from the March of Dimes, both awarded to MSG.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) | Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 mo at 4°C. | ||
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | methanol-free to preserve GFP fluorescence |
| 30G x 1/2 inch needle | VWR | BD305106 | Regular bevel |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten female flies |
| Bovine Serum Albumin | PAA-cell culture company | A15-701 | Used in NP40 Wash Buffer |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich | D9542 | 5mg/ml stock solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Added to supplement dissection medium (10%) |
| Glass culture tube | VWR | 47729-576 | 14mL |
| Glass Depression Slides | VWR | 470019-020 | 1.2 mm Thick, Double Cavity |
| Glycerin Jelly | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mounting media |
| Glycerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% in PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (interchangable for Nonidet P-40) Used in NP40 Wash Buffer |
| Leica Fluorescent Stereoscope | Leica Microsystems | ||
| Leica SP5 Confocal Microscope | Leica Microsystems | 40x/0.55NA dry objective | |
| Micro spatula | VWR | 82027-518 | Stainless steel |
| Microknife | Roboz Surgical Instrument Company | 37-7546 | 45ᵒ angle |
| Microscope Slide | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Wash Buffer | 50mM TRIS-HCL, 150mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide | ||
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Life Technologies | 10378-016 | Added to supplement dissection medium (0.6X) |
| Petridish- Polysterine, sterile | VWR | 82050-548 | 60Wx15H mm |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 packs of Powder |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786-500G | Used in 0.1M KPO4 Buffer |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791-500G | Used in 0.1M KPO4 Buffer |
| Schneider’s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 |
With L-glutamine and sodium bicarbonate |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | Used in fluorescent antibody staining |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | Used in NP40 Wash Buffer |
| TRIS-HCL | IBI Scientific | IB70144 | 1M TRIS-HCL, pH 7.4 |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | For processing confocal Z-stacks |
References
- Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
- Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
- Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).
- Bilder, D., Haigo, S. L. Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg. Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).
- Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).
- Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. , 1-70 (1993).
- Montell, D. J. Border-cell migration: the race is on. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).
- Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila. Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).
- Ghiglione, C., et al. The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis. Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).
- Denef, N., Schüpbach, T. Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium. Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).
- Beccari, S., Teixeira, L., Rørth, P. The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis. Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).
- Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP. Cell. 71 (1), 51-62 (1992).
- Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium. Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).
- McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells. Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).
- Van de Bor, V., Zimniak, G., Cérézo, D., Schaub, S., Noselli, S. Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness. Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).
- Hayashi, Y., et al. Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen. Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).
- Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells. J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).
- Rørth, P., et al. Systematic gain-of-function genetics in Drosophila). Development. 125 (6), 1049-1057 (1998).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
- Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis. Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).
- Quiñones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. Génétique. 175 (3), 1089-1104 (2007).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Génétique. 175 (3), 1505-1531 (2007).
- Belu, M., et al. Upright imaging of Drosophila embryos. J Vis Exp. (43), (2010).
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).
