Imagerie Montant du<em&gt; Drosophila</em&gt; Chambres d&#39;oeufs

Résumé

La méthode d’imagerie verticale décrite dans ce protocole permet de visualiser en détail les pôles d’un œuf de Drosophila melanogaster en développement. Cette vue d’ensemble offre une nouvelle perspective sur les arrangements et les morphologies de plusieurs types de cellules dans l’épithélium folliculaire.

Résumé

L’ovogenèse de Drosophila melanogaster offre un contexte idéal pour l’étude de divers processus de développement, car l’ovaire est d’architecture relativement simple, bien caractérisé et se prête à l’analyse génétique. Chaque chambre d’ovule est constituée de cellules germinales entourées d’une seule couche épithéliale de cellules folliculaires somatiques. Des sous-ensembles de cellules folliculaires subissent une différenciation au cours d’étapes spécifiques pour devenir plusieurs types de cellules différents. Les techniques standard permettent principalement une vue latérale des chambres d’ovules, et donc une vue limitée de l’organisation et de l’identité des cellules folliculaires. Le protocole d’imagerie verticale décrit une technique de montage qui permet une nouvelle vue verticale des chambres d’œufs avec un microscope confocal standard. Les échantillons sont d’abord montés entre deux couches de gelée de glycérine en position latérale (horizontale) sur une lame de microscope en verre. La gelée avec des chambres d’œufs enfermées est ensuite coupée en blocs, transférée sur une lamelle et retournée pour positionner les chambres d’œufs à la verticale. Les chambres d’œufs montées peuvent être imagées à l’aide d’un microscope confocal vertical ou inversé. Cette technique permet d’étudier la spécification, l’organisation, les marqueurs moléculaires et le développement des ovules avec de nouveaux détails et sous un nouvel angle.

Introduction

Etude de Drosophila melanogaster a fourni de grandes connaissances dans la régulation génétique d'un large éventail de phénomènes. En particulier, il ya eu des recherches approfondies sur le développement des œufs, parce oogenèse fournit un moyen souple pour enquêter sur de nombreux processus de développement différents, y compris les motifs des tissus, des changements de polarité cellulaire, la commutation du cycle cellulaire, et la réglementation de translation ^1,2,3,4. Un événement important au cours de l'ovogenèse morphogénétique est la spécification, l'acquisition de la motilité et la migration d'un ensemble de cellules appelé....

Protocole

1. Dissection de ovarioles

1. Transférer environ quinze 2-4 jours d'âge mouches femelles et quelques hommes d'une mouche des aliments frais flacon avec de la levure sèche active ajoutée. Utilisez le coton comme une prise pour les flacons, et ajouter quelques gouttes d'eau au coton pour maintenir l'humidité élevée.
2. Lieu flacon dans un incubateur à 25 ° pour 14-16 h pour maximiser le nombre de l'étape 8-10 chambres d'œufs.
   NOTE: Le temps d'incubation varie selon la température et stade désiré.
3. Préparer les médias de dissection, 0,1 M KPO ₄ et NP40 solutions au besoin pour le lendemain (voir Matér....

Résultats

La méthode d'imagerie verticale nous a permis de voir directement l'organisation des cellules de l'épithélium folliculaire antérieure à l'étape 8. Un marqueur général pour le destin des cellules du follicule, l'Absent Eyes (EYA) protéine, ainsi que le marqueur d'ADN nucléaire DAPI, a montré même l'expression à travers ce champ de cellules, et ont montré que toutes les cellules ont pu être observés avec des intensités de coloration similaires (figure 2B "). Les protéines .......

Discussion

Nous décrivons ici une méthode pour monter et petite image, développer chambres d'œufs dans une perspective de fin sur. Techniques communes pour les chambres imagerie d'œufs sont optimisés pour des vues latérales et permettent principalement la visualisation précise des cellules folliculaires médio-latérale lorsqu'ils sont colorés avec des anticorps fluorescents. L'utilisation de piles ou Z-3-D reconstitutions aides à la visualisation de plusieurs plans focaux, mais est encore insuffisante pour la résolu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,1 M Tampon phosphate de potassium (KPO4 Buffer)			Ajouter 3,1 g de NaH2PO4&bull ; H2O et 10,9 g de Na2HPO4 (anhydre) à H2O distillé pour obtenir un volume de 1 L. Le pH de la solution finale sera de 7,4. Ce tampon peut être stocké jusqu’à 1 mois à 4 °C.
Solution aqueuse de paraformaldéhyde à 16 %,	microscopie électronique de	15710	sans méthanol pour préserver la fluorescence GFP
Aiguille 30G x 1/2 pouce  ;	VWR	BD305106	Biseau régulier
Levure sèche active	Genesee Scientific	62-103	Pour engraisser les mouches femelles
Albumine sérique bovine Entreprise	de culture cellulaire	PAA A15-701	Utilisé dans NP40 Tampon de lavage
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11295-10	Alliage Dumostar, pointe de biologie ; les pointes acérées sont essentielles pour la dissection de l’ovariole
DAPI (dichlorhydrate de 4&prime ;,6-diamidino-2-phénylindole)	Sigma Aldrich	D9542	5 mg/ml solution mère  ;   ;
Sérum fœtal bovin (FBS)	Life Technologies	16140-071	Ajouté au supplément moyen de dissection (10 %)  ;
Tube de culture en verre	VWR	47729-576	14 ml
Lames de dépression en verre	VWR	470019-020	1,2 mm d’épaisseur, double cavité
Gelée de glycérine  ;	Microsocpy électronique Sciences	17998-10	Média de montage
Glycérol	IBI Scientific	IB15760	70 % en PBS
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	I3021-500ML	(interchangeable pour Nonidet P-40)  ; Utilisé dans le tampon de lavage NP40  ;
Stéréoscope fluorescent Leica  ;	Leica Microsystems
Microscope confocal Leica SP5	Leica Microsystems		40x/0.55NA.
Micro spatule  ;	VWR	82027-518 Lame de	en acier inoxydable
	VWR	16004-368	75x25x1 mm
NP40 Tampon			50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0,5 % Ipegal, 1 mg/ml BSA et 0,02 % d’azoture de sodium
Pénicilline-Streptomycine-Glutamine	Life Technologies	10378-016	Ajouté au complément milieu de dissection (0.6X)
Pétridis- Polystérine, stérile	VWR	82050-548	60 W x 15 H mm
Tampon de phosphate salin	Sigma Aldrich	P3813-10PAK	10 paquets de
poudre de phosphate de potassium dibasique	Sigma Aldrich	P3786-500G	Utilisé dans 0,1 M KPO4 Buffer  ;
Phosphate de potassium monobasique	Sigma Aldrich	P9791-500G	Utilisé dans 0,1 M KPO4 Buffer  ;
[en-tête]
Schneider' s Insect Medium	Life Technologies	11720018	Avec de la L-glutamine et
du bicarbonate de sodium Azoture de sodium	Sigma Aldrich	S2002-25G	Utilisé dans la coloration par anticorps fluorescents
Chlorure	de sodium Sigma Aldrich	S3014-500G	Utilisé dans le tampon de lavage NP40
TRIS-HCl	IBI Scientific	IB70144	1 M TRIS-HCl, pH 7,4
Volocité Image 3D Logiciel d’analyse	PerkinElmer		Pour le traitement des piles Z confocales

qualité EM Sciences Objectif sec microscope de lavage