Un metodo semplice e poco costoso per la determinazione fredda sensibilità e adattamento nei topi
Summary
The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 °C and 5 °C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.
Abstract
Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 °C to 5 °C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.
Introduction
Misurare reattività freddo nei roditori è importante per migliorare la comprensione dei potenziali meccanismi di sensibilità freddo negli esseri umani sia in condizioni normali e patologiche. The Cold plantare Assay (CPA), originariamente sviluppato diversi anni fa 1, è stato progettato per generare risposte riproducibili, inequivocabili murine comportamentali a uno stimolo freddo consegnato a RT. Miglioramenti più recenti di questo test hanno permesso la misurazione riproducibile di sensibilità fredda in un ampio intervallo di temperature 2. Entrambe le versioni sono inoltre progettati per essere relativamente alto rendimento, e poco costoso da utilizzare.
Una grande quantità di progressi sono stati compiuti nella comprensione dei meccanismi di sensibilità a freddo utilizzando altri metodi comportamentali. Un metodo è il test di evaporazione acetone, che comporta tamponando o spruzzando acetone sulla zampa mouse e misurando la quantità di tempo che il mouse spende portando l'3,4 zampa. Purtroppo,le risposte alla acetone evaporazione sono confusi dalla sensazione umida e l'odore del acetone. Inoltre, lo stimolo fredda che viene applicato durante la prova di evaporazione acetone può variare in base alla quantità di acetone applicata, ed è difficile da quantificare. Infine, i topi hanno risposte indenni minime quantità di acetone al basale, rendendo impossibile misurare l'analgesia in assenza di ipersensibilità con questo metodo.
Un altro test classico per le risposte a freddo è il test coda flick, dove la latenza di recesso viene misurata dopo la coda è immerso in 5,6 acqua fredda. Mentre le risposte comportamentali in questo saggio sono inequivocabili e il test misurano risposte ad una temperatura specifica, gli animali devono essere trattenuti durante la prova, che possono alterare la risposta fredda attraverso ben definite meccanismi analgesici da stress 7.
Un altro strumento comunemente usato è il test della piastra fredda, che misura il comportamentorisposte di topi dopo che sono posti su una piastra di Peltier raffreddato 8-10. Mentre questo strumento fornisce informazioni sulle risposte animale a temperature specifiche, è stato anche utilizzato incoerente; diversi gruppi hanno misurato diversi tipi di risposte incluso il numero di salti 8,11, la latenza alla prima risposta 8,11- 13, e il numero di ascensori paw 11,13,14 con risultati molto diversi. Il saggio piastra fredda è relativamente bassa capacità, come solo un animale può essere testato per volta, e richiede un dispositivo Peltier costosi e fragili.
Il test preferenza temperatura 2-piastra è un derivato comunemente usato per il test della piastra fredda che misura la quantità relativa di tempo che gli animali passano su 2 piastre collegate delle diverse temperature 9,15- 17. Un altro simile test comunemente usato è il saggio gradiente termico, in cui la quantità di tempo che i topi passano in differenti zone di temperaturacompresa tra 5 ° C e 45 ° C su una piastra metallica lunga 16 viene misurata. Mentre questi test permettono il confronto delle temperature, non è chiaro se il comportamento rappresenti avversione temperatura o di preferenza temperatura.
Infine, la dinamica dosaggio piastra fredda è stato usato per misurare quanto topi rispondono alle mutevoli temperatura ambiente 18. Questo metodo prevede il posizionamento mouse su un dispositivo Peltier RT e rampa verso il basso per 1 ° C durante la misurazione di quanto i topi saltano o leccarsi le zampe a temperature diverse placche. Mentre questo test come topi adattarsi ad un ambiente di raffreddamento, non fornisce un modo per testare come topi rispondono ad uno stimolo freddo nella cornice di una temperatura ambiente più fresco. Inoltre, richiede attrezzature costose effettuare e non fornisce un modo per acclimatare topi all'apparecchiatura prova prima di misurare la loro sensibilità fredda.
Per completare questi test, il CPA testa il ACCLIMAted risposte ad uno stimolo fredda ben definito in una varietà di campi di temperatura, o durante il processo di adattamento a temperature ambiente freddo. Si può testare fino a 14 topi alla volta con il nostro apparato attuale, con la possibilità di essere a buon mercato in scala per i test high-throughput.
Protocol
Representative Results
Discussion
The CPA can be used to assess cold sensitivity and cold adaptation in mice. It provides an affordable, efficient way to measure cold responses in unrestrained, acclimated animals at a wide variety of temperature ranges. It also provides an unambiguous behavioral response with an easily quantified and analyzed output variable. It has already been used to assess changes in cold sensitivity induced by inflammation1, neuropathic injury1, analgesics1, genetic knockouts20, and ge…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge contributions from the entire Gereau Lab for manuscript editing. This work is supported by NINDS funds 1F31NS078852 to DSB and NINDS fund NS42595 to RWG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T-type thermocouple probe | Physitemp | IT-24p | Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/) |
| Glass plate | Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc) | N/A | We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4'', but 3/16'' and 1/8'' are also useful |
| Thermal Data logger | Extech | EA15 | Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408) |
| 3mL Syringe | BD | 309657 | The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe |
| Computer | If using Extech logger, any Pcwill work | N/A | |
| Aluminum boxes | Washington University in St. Louis machine shop | N/A | boxes are 3' long, 4.5'' wide, and 3'' tall with a sealed lid. There is a 1/2'' hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water. |
| Heated water circulator | VWR | Any water circulator model with a pump will work | |
| 21 gauge needle | BD | 305165 | The exact needle size is not important |
| Hand timer | N/A | Any hand timer will work | |
| Mirror | N/A | Any flat mirror will work |
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