Un método simple y barato para la Determinación de la sensibilidad al frío y Adaptación en ratones

Summary

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 °C and 5 °C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Abstract

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.

Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 °C to 5 °C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.

This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Introduction

Medición de la capacidad de respuesta frío en roedores es importante para mejorar la comprensión de los mecanismos potenciales de sensibilidad al frío en los seres humanos, tanto en condiciones normales y patológicas. El Plantar Ensayo Fría (CPA), originalmente desarrollado hace varios años ^1, está diseñado para generar respuestas reproducibles, sin ambigüedades murinos de comportamiento a un estímulo frío entregado a temperatura ambiente. Más recientes mejoras de este ensayo han permitido la medición reproducible de sensibilidad al frío en una amplia gama de temperaturas de ^2. Ambas versiones también están diseñados para ser relativamente de alto rendimiento, y barato de usar.

Una gran parte de los avances se han logrado en la comprensión de los mecanismos de la sensibilidad al frío utilizando otros métodos de comportamiento. Un método es la prueba de la evaporación de acetona, que implica frotando o pulverización acetona en la pata del ratón y midiendo la cantidad de tiempo que gasta el ratón agitando el ^3,4 pata. Desafortunadamente,las respuestas a la evaporación de acetona son confundidos por la sensación de humedad y el olor de la acetona. Además, el estímulo frío que se aplica en la prueba de la evaporación de acetona puede variar en función de la cantidad de acetona aplicado, y es difícil de cuantificar. Finalmente, los ratones no lesionados tienen respuestas mínimas a acetona al inicio del estudio, por lo que es imposible medir la analgesia en ausencia de hipersensibilidad con este método.

Otro ensayo clásico para las respuestas frías es el ensayo de retirada de la cola, donde se mide la latencia a la retirada después de la cola se encuentra inmersa en ^5,6 agua fría. Mientras que las respuestas de comportamiento en este ensayo son inequívocos y el ensayo mide las respuestas a una temperatura específica, los animales deben estar sujetos durante la prueba, lo que puede alterar la capacidad de respuesta fría a través de bien descritos mecanismos analgésicos inducidos por el estrés ^7.

Otra herramienta comúnmente usada es la prueba de la placa fría, que mide el comportamientorespuestas de los ratones después de que se colocan en una placa Peltier enfriado ^8-10. Mientras que esta herramienta proporciona información sobre respuestas de los animales a temperaturas específicas, también se ha utilizado de manera incompatible; diferentes grupos han medido diferentes tipos de respuestas, incluyendo el número de saltos ^8,11, la latencia hasta la primera respuesta ^{8,11- 13,} y el número de la pata ascensores ^11,13,14 con resultados muy diferentes. El ensayo de placa de frío es también relativamente bajo rendimiento, ya que sólo un animal puede ser probado a la vez, y requiere un dispositivo peltier caros y frágiles.

La prueba de preferencia la temperatura de la placa 2 es un derivado de uso común de la prueba de la placa fría que mide la cantidad relativa de tiempo que los animales pasan en 2 placas conectadas de diferentes temperaturas ^{9,15- 17.} Otro ensayo comúnmente utilizado similar es el ensayo de gradiente térmico, donde la cantidad de tiempo que los ratones que pasan en diferentes zonas de temperaturaque oscila entre 5 ° C y 45 ° C en una placa de metal larga se mide ^16. Si bien estos ensayos permiten la comparación de temperaturas, no está claro si el comportamiento representa la temperatura o la aversión a la preferencia de la temperatura.

Por último, el ensayo de placa fría dinámica ha sido utilizado para medir cómo los ratones responden a los cambios de temperatura ambiente ^18. Este método consiste en colocar los ratones en un dispositivo peltier RT y el aumento gradual de abajo a 1 ° C, mientras que la medición de la cantidad de los ratones saltan o se lamen las patas a diferentes temperaturas de la placa. Si bien esta prueba cómo los ratones adaptarse a un entorno de enfriamiento, que no proporciona una forma de probar cómo los ratones responden a un estímulo frío en la configuración de un refrigerador de temperatura ambiente. Adicionalmente, se requiere un equipo costoso para llevar a cabo y no proporciona una manera para aclimatarse a los ratones el equipo de prueba antes de medir su sensibilidad al frío.

Para complementar estos ensayos, el CPA pone a prueba la ACCLIMAted respuestas a un estímulo frío bien definido en una variedad de rangos de temperatura, o durante el proceso de adaptación a climas fríos. Se puede probar hasta 14 ratones a la vez con nuestro aparato actual, con el potencial de ser económicamente a escala para ensayos de alto rendimiento.

Protocol

Todos los protocolos de ratón estaban de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por el Comité de Estudios Animal de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington (St. Louis, MO). 1. Preparación de la Bandeja de Pruebas y Cajas Limpie la superficie del cristal. Fije la sonda de termopar de tipo T filamento a la superficie en el medio de la placa de vidrio con cinta de laboratorio. Coloca los recintos de los animales sobre …

Representative Results

Las respuestas de comportamiento inducidos a partir de ratones a partir de 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, y 12 ° C son altamente reproducible (Figura 4A) 20. Con el fin de medir el estímulo frío que se genera bajo la pata trasera, los ratones fueron anestesiados con una mezcla de ketamina / xilazina / acepromazina cóctel y sus patas fueron asegurados en el cristal en la parte superior de un termopar de tipo T filamento (Figura 4B) 20. El vidrio se enfría o se cali…

Discussion

The CPA can be used to assess cold sensitivity and cold adaptation in mice. It provides an affordable, efficient way to measure cold responses in unrestrained, acclimated animals at a wide variety of temperature ranges. It also provides an unambiguous behavioral response with an easily quantified and analyzed output variable. It has already been used to assess changes in cold sensitivity induced by inflammation¹, neuropathic injury¹, analgesics¹, genetic knockouts²⁰, and ge…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
T-type thermocouple probe	Physitemp	IT-24p	Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)
Glass plate	Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc)	N/A	We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4'', but 3/16'' and 1/8'' are also useful
Thermal Data logger	Extech	EA15	Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)
3mL Syringe	BD	309657	The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe
Computer	If using Extech logger, any Pcwill work	N/A
Aluminum boxes	Washington University in St. Louis machine shop	N/A	boxes are 3' long, 4.5'' wide, and 3'' tall with a sealed lid.  There is a 1/2'' hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water.
Heated water circulator	VWR		Any water circulator model with a pump will work
21 gauge needle	BD	305165	The exact needle size is not important
Hand timer	N/A		Any hand timer will work
Mirror	N/A		Any flat mirror will work