Detecção de alvos miRNA em métodos de alta capacidade utilizando o ensaio 3'LIFE
Summary
Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.
Abstract
Luminescente Identificação de elementos funcionais em 3'UTRs (3'LIFE) permite a rápida identificação de alvos de miRNAs específicos dentro de uma matriz de centenas de 3'UTRs consultados. Identificação do alvo baseia-se no ensaio de luciferase dupla, que detecta a ligação ao nível do ARNm por medição da produção de translação, dando uma leitura funcional de miARN alvo. 3'LIFE usa buffers não-proprietários e reagentes, e bibliotecas repórter publicamente disponíveis, tornando as telas do genoma viável e rentável. 3'LIFE pode ser realizada quer num ambiente de laboratório padrão ou ampliados usando robôs de manipulação de líquidos e outros instrumentos de alto rendimento. Nós ilustrar a abordagem que utiliza um conjunto de dados de 3'UTRs humanos clonados em placas de 96 alvéolos, e duas miARNs de teste, deixa-7c e miR-10b. Nós demonstramos como realizar a preparação de DNA, transfecção, cultura de células e ensaios de luciferase em formato de 96 poços, e fornecer ferramentas para dadosanálise. Em conclusão 3'LIFE é altamente reprodutível, rápida, sistemática e identifica alvos elevados de confiança.
Introduction
O objetivo geral deste método é detectar e mapear precisamente microRNA (miRNA) em alvos de alto rendimento. MiRNAs são ARNs endógeno não-codificantes ~ 22 nucleótidos de comprimento. Após a transcrição e processamento, miARNs maduros são incorporadas num complexo proteína chamada o ARN de silenciamento induzido complexo (RISC). Cada miRNA orienta o RISC de elementos localizados principalmente nas regiões 3'untranslated (3'UTRs) de RNA mensageiro (mRNA) alvo, resultando em repressão ou tradução ou clivagem mRNA 1. Mirna reconhecer sites de destino com base no padrão de Watson-Crick e G: U oscilar base emparelhamento, e são degenerados na natureza, que contém vários pares de bases incompatíveis e regiões incharam. Muitos miARNs são amplamente conservada de plantas para os seres humanos 2,3, em que desempenham uma grande variedade de funções biológicas. Em metazoans miRNAs pode influenciar vários processos biológicos incluindo as decisões do destino da célula 4, o calendário de desenvolvimento 5 </sup> E, freqüentemente, apresentam padrões de expressão específicos de tecidos 6,7. MiARN misexpression também pode resultar na regulação do gene aberrante, que pode ter uma influência significativa no comportamento das células com base unicamente na função de genes alvo. Como tal, miARNs estão ligadas a uma ampla gama de doenças, incluindo a neurodegeneração 8,9, diabetes 10 e 11 do cancro. Bioinformática e abordagens molhado de bancada sugerem que cada miARN pode ser capaz de se direccionar centenas a milhares de ARNm distintas 12-14, o que indica que de alto rendimento ou do genoma abordagens de largura são necessários para investigar este grande grupo de potenciais interacções.
Identificar genes-alvo é um componente crítico de mechanistically definindo função miRNA, e para isso os pesquisadores devem ser capazes de revelar alvos em grande escala. Várias abordagens foram desenvolvidas para identificar alvos de miARN, incluindo algoritmos de previsão de bioinformática, sequenciação de alto rendimentodo ARNm alvo, e ensaios baseados repórter. Cada uma dessas abordagens tem pontos fortes e fraquezas inerentes. Dado que miARN direccionamento é guiado pela especificidade da sequência, especialmente de 2-6 nucleótidos de miARN (denominada região da semente), vários algoritmos foram desenvolvidos para prever alvos miARN ao longo do genoma de muitos organismos. Esses algoritmos são treinados usando os motivos de emparelhamento de bases observados de alvos miRNA validados, e freqüentemente utilizam parâmetros como emparelhamento rigorosas de sementes, conservação de sítios, e / ou estabilidade termodinâmica 15. Embora esses filtros refinar o grande número de possíveis alvos com complementaridade suficiente para destinos somente altos de confiança, eles podem excluir espécies locais específicos e não-canônicos alvo de miRNA, evidências recentes sugerem que são difundidos 16-24. Além disso, estas previsões não têm em conta os mecanismos de processamento de mRNA que excluem locais alvo de miRNA, tais como poliadenilação alternativa25, edição de 26 de RNA, RNA metilação 27, e ligação cooperativa. Como tal, as altas taxas positivos e falsos negativos falsos têm sido relatados por muitos algoritmos 22,24,28. Enquanto estes algoritmos são úteis para identificar candidatos alvos miRNA para validação experimental posterior, estas taxas de erro elevadas limitar a eficácia de abordagens de bioinformática para miRNA detecção do alvo sistemático.
Para sondar sistematicamente as interacções entre uma dada miARN e 3'UTRs potencialmente segmentados temos desenvolvido um ensaio de elevado débito chamados luminescentes Identificação de elementos funcionais na 3'UTRs (3'LIFE 24). Este ensaio mede interacções directas e repressão de translação da 3'UTR de teste por uma consulta miARN utilizando um sistema repórter de luciferase duplo. Neste sistema, o 3 'UTR de um gene de interesse é clonado a jusante da luciferase (FLUC) repórter grelha de leitura do pirilampo. Os contras repórtertruct é co-transfectado com uma consulta de miARN em células HEK293T. MiARN direccionamento é determinada pela medição da alteração relativa entre o FLUC teste :: repórter 3'UTR e um segundo não específica repórter de luciferase de Renilla. Importante, ensaios de luciferase detectar interacções funcionais miARN / ARNm que influenciam a saída de translação do repórter. Esta é uma das principais vantagens sobre os métodos tradicionais para detectar regulamento miRNA, como RT-qPCR e Western blot, em que este ignora diferenças na degradação do mRNA e repressão translacional, bem como mudanças na abundância de proteína independente de regulação baseada 3'UTR.
Os ensaios de luciferase são amplamente utilizados para validar alvos diretos de miRNA por causa de sua relativa simplicidade e sensibilidade, mas seu uso em telas de alto rendimento é limitado por elevados custos associados com reagentes de consumo, a falta de bibliotecas 3'UTR de fontes públicas, ea ausência de prot luciferase padronizadaocols, levando a dificuldades na comparação de repressão funcional em vários conjuntos de dados. Para facilitar a utilização do ensaio 3'LIFE, nós colocamos ênfase na simplificação do design experimental, a utilização de transfecção 24 e luciferase reagentes não-comerciais 29, criando uma biblioteca 3'UTR que é regularmente atualizada e expandida, e está disponível através um repositório plasmídeo público 30.
A escalabilidade do ensaio 3'LIFE permite o rastreio de uma grande biblioteca 3'UTR para segmentação por um determinado miRNA sem polarização da tela em direção genes bioinformatically identificados. Além de testar interacções canónicos e preditos, esta abordagem permite a identificação sistemática de novos alvos impulsionados através de interacções não canónicos e / ou específica da espécie. Importantemente, o efeito da miARN alvo na produção de proteína é geralmente entendida para resultar em modesta repressão translacional 15,31 </ Sup>, sugerindo que um papel principal de regulação miRNA é para afinar saída proteína, proteger contra os níveis de expressão de genes aberrantes, e proporcionam robustez a célula programas específicos 32,33. A sensibilidade do ensaio de luciferase combinado com o inerentemente grande número de interacções miARN / ARNm negativos na tela de 3'LIFE permite a detecção de efeitos subtis da miARN alvo em um grande número de genes, e a identificação de múltiplos componentes de redes de genes que são regulados por um determinado miRNA 24.
Aqui nós descrevemos o protocolo 3'LIFE, e demonstrar que é viabilidade pela triagem dois miRNAs bem caracterizados, miR-10b e deixe-7c contra um painel de 275 3'UTRs humanos (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
O ensaio 3'LIFE identifica alvos miRNA funcionais em 3'UTRs em high-throughput. Este ensaio é útil para investigadores que desejam identificar experimentalmente um grande número de possíveis alvos para a sua miARN de interesse. O ensaio 3'LIFE é uma abordagem poderosa para consultar 3'UTR regulação accionado, em que o ensaio fornece uma medida funcional de miARN direccionamento, e o teste de binário de um único repórter :: 3'UTR contra um único miARN pode confiantemente tratar o estado de …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.
Materials
| Reagents | ||
| glycylglycine | Sigma | G1127-25G |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 |
| EGTA | Sigma | E3889 |
| ATP | Sigma | FLAAS |
| DTT | Sigma | D0632 |
| MgSO4 | Sigma | M7506 |
| CoA | Sigma | C4282 |
| luciferin | Sigma | L9504 |
| NaCl | Sigma | S7653 |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 |
| BSA | Sigma | A2153 |
| NaN3 | Sigma | S2002 |
| Coelenterazine | Sigma | C3230 |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| FBS | Sigma | F2442 |
| Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 |
| Trypsin | T2600000 | |
| Consumables | ||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 |
| 96-well miniprep plate | Pall | 8032 |
| 96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 |
| 5x Lysis Buffer | Promega | E1941 |
| Instruments | ||
| 96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 |
| Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 |
| 96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 |
| Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
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