Обнаружение микроРНК цели в высокой пропускной Использование 3'LIFE Пробирной
Summary
Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.
Abstract
Люминесцентные Идентификация функциональных элементов в 3'UTRs (3'LIFE) позволяет быструю идентификацию целей конкретных микроРНК в массиве сотен запрашиваемых 3'UTRs. Целевой идентификации основан на двойной люциферазы, который обнаруживает связывания на уровне мРНК путем измерения поступательное выход, давая функциональный считывание микроРНК ориентации. 3'LIFE использует неимущественные буферы и реагенты, и публично доступные репортер библиотеки, делая генома экраны целесообразным и экономически эффективным. 3'LIFE может быть выполнена либо в стандартном лабораторных или расширены с использованием жидких роботов обработки и другой высокой пропускной приборы. Проиллюстрируем подход с использованием набора данных человеческих 3'UTRs клонированных в 96-луночных планшетах, и двух испытаний микроРНК, пусть-7c, и микроРНК-10b. Мы показываем, как выполнять препарат ДНК, трансфекцию, культуры клеток и люциферазы анализов в формате 96-луночного, и предоставляют инструменты для передачи данныхАнализ. В заключение 3'LIFE хорошо воспроизводим, быстрый, систематический и определяет высокие цели доверительные.
Introduction
Общая цель этого метода заключается в выявлении и точно карту микроРНК (микроРНК) цели в высокой пропускной. МикроРНК эндогенные некодирующие РНК ~ 22 нуклеотидов в длину. После транскрипции и обработки, зрелые микроРНК включены в белковый комплекс называется РНК индуцированного глушителей комплекса (RISC). Каждый микроРНК направляет RISC целевых элементов, расположенных в основном в регионах 3'untranslated (3'UTRs) в матричных РНК (мРНК), в результате чего либо репрессий перевода или мРНК расщепления 1. Мирна признать целевые сайты, основанные на стандартной Уотсона-Крика и G: U раскачиваться спаривание оснований, и вырождаются в природе, содержащий несколько ошибочно спаренных пар оснований и выпучил регионы. Многие микроРНК широко сохраняется от растений до человека 2,3, где они играют широкий спектр биологических функций. В многоклеточных микроРНК могут влиять несколько биологических процессов, включая судьбы клеток решениями 4, сроков развития 5 </sup> И часто демонстрируют тканеспецифические паттерны экспрессии 6,7. Мирна неправильная экспрессия может также привести к аномальным регуляции генов, которые могут иметь существенное влияние на поведение клеток, основанной исключительно на функции генов-мишеней. Таким образом, микроРНК связаны с широким спектром заболеваний, в том числе нейродегенеративных 8,9, диабета и рака 10 11. Биоинформационный и мокрого стендовые подходы позволяют предположить, что каждая микроРНК могут быть способны ориентации от сотен до тысяч различных мРНК 12-14, что указывает на высокую пропускную способность или геномные широкие подходы для зонда этот большой круг потенциальных взаимодействий.
Определение целевых генов критическим компонентом механистически определяющей функции микроРНК, и сделать так, исследователи должны быть в состоянии выявить цели на больших масштабах. Несколько подходов были разработаны для выявления микроРНК целей, в том числе по биоинформатике алгоритмов прогнозирования, высокой пропускной последовательностицелевых мРНК, и журналистом анализов. Каждый из этих подходов имеет присущие сильные и слабые стороны. Учитывая, что микроРНК нацеливание ориентируется на специфичность последовательности, в первую очередь из нуклеотидов 2-6 миРНК (называемый запальной зоне), несколько алгоритмов были разработаны, чтобы предсказать целевые микроРНК во всем геноме многих организмов. Эти алгоритмы обучаются с помощью наблюдаемых спаривание оснований мотивы проверенных целей микроРНК, и часто используют такие параметры, как строгий семян спаривания, сохранения сайте, и / или термодинамической стабильности 15. В то время как эти фильтры результаты большого количества предполагаемых целей с достаточной комплементарности к только высоких целей доверия, они могут исключить видовой и неканонические микроРНК целевых сайтов, которые последние данные свидетельствуют о широко распространены 16-24. Кроме того, эти прогнозы не учитывают механизмы процессинга мРНК, которые исключают микроРНК целевых сайтов, таких как альтернативного полиаденилирования25, 26 редактирование РНК, РНК метилирование 27 и кооперативное связывание. Таким образом, высокие ложные положительные и ложные отрицательные темпы были зарегистрированы в течение многих алгоритмов 22,24,28. В то время как эти алгоритмы полезны для выявления возможных микроРНК целей для последующей экспериментальной проверки, эти высокие коэффициенты ошибок ограничить эффективность биоинформатики подходов к систематической микроРНК обнаружения цели.
Систематически исследовать взаимодействие между данной микроРНК и потенциально целевых 3'UTRs мы разработали высокой пропускной анализа под названием Люминесцентные Идентификация функциональных элементов в 3'UTRs (3'LIFE) 24. Этот анализ мер прямого взаимодействия и репрессии трансляции испытательного 3'UTR запросом микроРНК с использованием двойной системы люциферазы репортер. В этой системе, 3'-UTR из интересующего гена клонируют на выходе из люциферазы светлячка (fluc) репортера рамке считывания. Репортер минусыtruct котрансфицирована с запросом микроРНК в клетках HEK293T. МикроРНК нацеливание определяется путем измерения относительного изменения между испытательной fluc :: 3'UTR репортера и второй неспецифической репортера люциферазы Renilla. Важно отметить, что люциферазы анализы обнаружить функциональные взаимодействия микроРНК / мРНК, которые влияют на поступательное выход репортера. Это главное преимущество по сравнению с традиционными методами для обнаружения регулирования микроРНК, например, RT-КПЦР и западных пятна, что это обходит различия в деградации мРНК и репрессии трансляции, а также изменения в белковых изобилии независимого регулирования, основанного 3'UTR.
Люциферазы анализы широко используются для проверки прямых целей микроРНК из-за их относительной простоты и чувствительности, но их использование в экранах с высокой пропускной способностью ограничено высоких затрат, связанных с расходными реагентами, отсутствие 3'UTR библиотек из общедоступных источников, и отсутствие стандартизированных люциферазы протocols, что приводит к трудностям в сравнении функциональную репрессии по нескольким наборам данных. Для облегчения использования 3'LIFE анализа, мы делали акцент на упрощение экспериментального проектирования, использования некоммерческих трансфекции 24 и люциферазных реагентов 29, создавая 3'UTR библиотеку, которая регулярно обновляется и расширяется, и доступна через хранилище общественной плазмиды 30.
Масштабируемость 3'LIFE анализа позволяет скрининг большого 3'UTR библиотеки для нацеливания на заданное миРНК без смещения в направлении экрана bioinformatically идентифицированных генов. В дополнение к тестированию канонические и предсказанные взаимодействия, это системный подход позволяет выявить новых целей приводом с помощью неканонических и / или видов-специфических взаимодействий. Важно отметить, что эффект микроРНК ориентации на производство белка, как правило, понимается привести к скромной репрессии трансляции 15,31 </ SUP>, предполагая, что основная роль регулирования микроРНК является точной настройки выходного белка, защиты от аберрантных уровней экспрессии генов, а также обеспечить надежность на мобильные конкретные программы 32,33. Чувствительность анализа люциферазы в сочетании с изначально большим числом отрицательных взаимодействий микроРНК / мРНК в экране 3'LIFE позволяет обнаруживать тонких эффектов микроРНК ориентации на большом количестве генов, и идентификацию множества компонентов генных сетей, которые регулируются данной микроРНК 24.
Здесь мы опишем протокол 3'LIFE, и продемонстрировать это технико-экономическое путем скрининга два хорошо охарактеризованные микроРНК Мир-10b, и пусть-7c против панели 275 человека 3'UTRs (рисунок 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
3'LIFE анализ выявляет функциональные цели микроРНК в 3'UTRs в высокой пропускной. Этот анализ является полезным для исследователей, которые хотят, чтобы экспериментально определить большое количество предполагаемых целей их микроРНК интерес. 3'LIFE анализ является мощным подход для з…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.
Materials
| Reagents | ||
| glycylglycine | Sigma | G1127-25G |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 |
| EGTA | Sigma | E3889 |
| ATP | Sigma | FLAAS |
| DTT | Sigma | D0632 |
| MgSO4 | Sigma | M7506 |
| CoA | Sigma | C4282 |
| luciferin | Sigma | L9504 |
| NaCl | Sigma | S7653 |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 |
| BSA | Sigma | A2153 |
| NaN3 | Sigma | S2002 |
| Coelenterazine | Sigma | C3230 |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| FBS | Sigma | F2442 |
| Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 |
| Trypsin | T2600000 | |
| Consumables | ||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 |
| 96-well miniprep plate | Pall | 8032 |
| 96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 |
| 5x Lysis Buffer | Promega | E1941 |
| Instruments | ||
| 96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 |
| Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 |
| 96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 |
| Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408 (6808), 86-89 (2000).
- Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B., Bartel, D. P. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16 (13), 1616-1626 (2002).
- Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 2 (3), 219-229 (2008).
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Wienholds, E., et al. MicroRNA expression in zebrafish embryonic development. Science. 309 (5732), 310-311 (2005).
- Darnell, D. K., et al. MicroRNA expression during chick embryo development. Dev Dyn. 235 (11), 3156-3165 (2006).
- Jin, P., Alisch, R. S., Warren, S. T. RNA and microRNAs in fragile X mental retardation. Nat Cell Biol. 6 (11), 1048-1053 (2004).
- Kim, J., et al. A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neurons. Science. 317 (5842), 1220-1224 (2007).
- Poy, M. N., et al. A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion. Nature. 432 (7014), 226-230 (2004).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
- Paraskevopoulou, M. D., et al. DIANA-microT web server v5.0: service integration into miRNA functional analysis workflows. Nucleic Acids Res. 41 (Web Server issue), W169-W173 (2013).
- Krek, A., et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3’UTR. Genes Dev. 18 (2), 132-137 (2004).
- Lal, A., et al. miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2, MYC, and other cell-cycle genes via binding to ‘seedless’ 3’UTR microRNA recognition elements. Molecular Cell. 35 (5), 610-625 (2009).
- Cevec, M., Thibaudeau, C., Plavec, J. N. M. R. NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).
- Shin, C., et al. Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing. Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).
- Azzouzi, I., et al. MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis. PLoS One. 6 (7), e22838 (2011).
- Chen, J., et al. miR-193b Regulates Mcl-1 in Melanoma. Am J Pathol. 179 (5), 2162-2168 (2011).
- Chi, S. W., Hannon, G. J., Darnell, R. B. An alternative mode of microRNA target recognition. Nat Struct Mol Biol. 19 (3), 321-327 (1038).
- Jiao, L. R., et al. MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors. PLoS One. 7 (2), e32068 (2012).
- Wolter, J. M., Kotagama, K., Pierre-Bez, A. C., Firago, M., Mangone, M. 3’LIFE: a functional assay to detect miRNA targets in high-throughput. Nucleic Acids Res. , (2014).
- Mangone, M., et al. The landscape of C. elegans 3’UTRs. Science. 329 (5990), 432-435 (2010).
- Ekdahl, Y., Farahani, H. S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development. Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation. Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Zhou, P., et al. Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3’UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs. Plos One. 8 (7), e68204 (2013).
- Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis. Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).
- Seiler, C. Y., et al. DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).
- Ebert, M. S., Sharp, P. A. Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes. Cell. 149 (3), 515-524 (2012).
- Pelaez, N., Carthew, R. W. Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective. Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).
