3'LIFE Test kullanma Yüksek throughput miRNA Hedefleri tespiti
Summary
Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.
Abstract
3'UTRs fonksiyonel Elementlerin Lüminesans Tanımlama (3'LIFE) sorgulanan 3'UTRs yüzlerce bir dizi içinde spesifik miRNA'ların hedefleri hızlı tanımlanmasını sağlar. Hedef tespiti MiRNA hedefleme işlevsel bir okuma verir translasyon çıkışının ölçülmesi mRNA düzeyinde bağlanmasını saptayan çift lusiferaz deneyi, dayanmaktadır. 3'LIFE genom ekranlar yapma tescilli olmayan tamponlar ve reaktifler ve kamuya açık muhabiri kütüphaneleri kullanır uygulanabilir ve maliyet-etkin. 3'LIFE standart laboratuar ortamında ya yapılmış ya da sıvı taşıma robotlar ve diğer yüksek verimli enstrümantasyon kullanılarak ölçeklendirilebilir. İnsan 96-yuvalı plakalar içinde klonlanmış 3'UTRs ve iki test miRNA'ların bir veri kümesi kullanılarak bir yaklaşımı göstermektedir, salma 7c ve miR-10b. Bu 96 gözlü bir formatta DNA hazırlama, transfeksiyon, hücre kültürü ve lusiferaz tahlilleri yerine ve veri için araçlar temin etmek gösterilmektedirAnaliz. Sonuç olarak 3'LIFE yüksek, tekrarlanabilir hızlı, sistematik ve yüksek güven hedeflerini belirler.
Introduction
Bu yöntemin genel amacı algılamak ve hassas yüksek throughput microRNA (miRNA) hedefleri harita etmektir. MiRNA ~ uzunluğu 22 nükleotid endojen kodlayıcı olmayan RNA'lar bulunmaktadır. Transkripsiyonu ve işleme sonrasında, olgun miRNA'lar bir protein kompleksi içinde dahil edilmiştir kompleksi (RISC) susturulması kaynaklı RNA çağırdı. Her miRNA çeviri baskıya veya mRNA bölünme 1 ya sonuçlanan öncelikle haberci RNA'lar 3 'çevrilmemiş bölgelerine (3'UTRs) (mRNA)' de yer alan unsurları hedef RISC yönlendirir. U baz eşleşmesi sallanmak ve olan dejenere doğada, birden eşleşmeyen baz çifti içeren ve bölgeler şişti: Mirna standart Watson-Crick ve G dayalı hedef siteleri tanır. Birçok miRNA'lar geniş biyolojik rolleri çeşitli bir yelpazede oynamak insanlarda 2,3 için bitkilerden muhafaza edilir. Metazoan'da ise miRNA'lar hücre kaderinin kararları 4, gelişimsel zamanlama 5 dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçleri etkileyebilir </sup> Ve çoğu zaman dokuya özgü ekspresyonu 6,7 sergiler. MIRNA misexpression aynı zamanda, hedef genlerin işlevine yalnızca temel hücre davranışı üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir olarak anormal gen regülasyonu, neden olabilir. Bu nedenle, miRNA'ların nörodejenerasyon 8,9, diyabet 10 ve kanser de dahil olmak üzere 11, hastalıkların geniş bir bağlantılıdır. Biyoinformatik ve ıslak tezgah yaklaşımları her miRNA yüksek verimli veya genom yaklaşımlar potansiyel etkileşimler bu büyük bir havuz soruşturma için gerekli olduğunu belirten farklı mRNA 12-14 binlerce yüz hedefleme yeteneğine sahip olabileceğini düşündürmektedir.
Hedef genlerin belirlenmesi mekanistik tanımlayan miRNA fonksiyonunun kritik bir bileşenidir, ve bunu yapmak için araştırmacılar büyük çapta hedeflerini ortaya gerekir. Çeşitli yaklaşımlar biyoinformatik tahmin algoritmaları da dahil olmak üzere miRNA hedefler, tanımlamak için geliştirilmiştir, yüksek hacimli dizilemebir mRNA'ları hedeflenen ve raportör deneyleri tabanlı. Bu yaklaşımların her biri doğal güçlü ve zayıf yanları vardır. MiRNA hedefleme sekansı özgüllük tarafından yönlendirilir olduğu göz önüne alındığında, özellikle nükleotid miRNA 2-6, çeşitli algoritmalar birçok organizma genomu boyunca MiRNA hedefleri tahmin etmek için geliştirilmiştir (tohum bölge olarak da adlandırılır). Bu algoritmalar valide miRNA hedeflerinin gözlenen baz eşleşmesi motifleri kullanılarak eğitimli ve sık sık bu tür sıkı tohum eşleştirme, site korunması ve / veya termodinamik stabilite 15 gibi parametreleri kullanan vardır. Bu filtreler sadece yüksek güven hedefleri için yeterli tamamlayıcılık ile olası hedeflerin çok sayıda rafine ederken, onlar son kanıtlar 16-24 yaygın olduğunu düşündürmektedir türe özel ve kanonik olmayan miRNA hedef siteleri, dışarıda olabilir. Ayrıca, bu tahminlerin gibi alternatif poliadenilasyonu olarak miRNA hedef siteleri, dışarıda mRNA işleme hesap mekanizmaları yapmayız25, RNA düzenleme 26, RNA metilasyonu 27 ve kooperatif bağlama. Bu nedenle, yüksek yanlış pozitif ve yanlış negatif oranları birçok algoritmalar 22,24,28 için rapor edilmiştir. Bu algoritmalar sonraki deneysel doğrulama için aday miRNA hedefler belirlemek için yararlı olmakla birlikte, bu yüksek hata oranları sistematik miRNA hedef tespiti için biyoinformatik yaklaşımların etkinliğini sınırlamaktadır.
Sistematik belirli bir miRNA arasındaki etkileşimler ve potansiyel olarak hedeflenmiş 3'UTRs problanması için biz 3'UTRs (3'LIFE) 24 fonksiyon elementleri arasında Lüminesans tanımlanması adı verilen bir yüksek verimli bir deney geliştirilmiştir. Bu tahlil ölçer doğrudan etkileşimleri ve çift lusiferaz haberci sistemini kullanarak bir sorgu miRNA test 3'UTR'sinden translasyon baskı. Bu sistemde, ilgi konusu bir genin 3'UTR ateşböceği lusiferaz (Fluc) raportör okuma çerçevesinin alt klonlanır. muhabir eksilerinitruct HEK293T hücrelerinde bir sorgu miRNA ile kotransfekte edilir. MIRNA hedefleme Test Fluc :: 3'UTR muhabir ve ikinci bir non-spesifik Renilla lusiferaz raportör arasındaki nispi değişimin ölçülmesi ile tespit edilir. Önemli olarak, lusiferaz deneyleri, raportör translasyon çıkış etkileyen fonksiyonel MiRNA / mRNA etkileşimlerini tespit eder. Bu bu 3'UTR tabanlı düzenlemenin bağımsız protein bolca mRNA bozulması ve translasyonel baskıya farklılıkları yanı sıra değişiklikleri atlar, bu tür RT-qPCR ve Western lekeleri olarak miRNA düzenleme, tespit etmek için geleneksel yöntemlere göre önemli bir avantajdır.
Lusiferaz deneyleri, yaygın olarak tüketilebilir reaktifler ile ilişkili yüksek maliyetler ile sınırlıdır, çünkü göreceli basitlik ve hassaslık, ancak, yüksek verimli taramalara kullanımları doğrudan MiRNA hedeflerini doğrulamak için kullanılır, kamu kaynaklarından 3'UTR kütüphanelerinin eksikliği ve yokluğu standart lusiferaz prot arasındaocols, birden veri setleri üzerinde fonksiyonel baskıya karşılaştırılmasında zorluklara yol açmaktadır. 3'LIFE testinin kullanımını kolaylaştırmak için, düzenli olarak güncellenen ve genişletilmiş bir 3'UTR kütüphane oluşturarak, deneysel tasarım, ticari olmayan transfeksiyon 24 ve lusiferaz reaktif 29 kullanımı basitleştirilmesi vurgu ve yoluyla kullanılabilir var kamu plazmid deposu 30.
3'LIFE testinin ölçeklenebilirlik bioinformatically belirlenen genler doğru ekranı eğme olmadan belirli bir miRNA tarafından hedef için büyük bir 3'UTR kütüphanenin tarama sağlar. Kanonik ve tahmin edilen etkileşimleri test etmek için ek olarak, bu sistematik bir yaklaşım, kurallı olmayan ve / veya tür spesifik etkileşimler yoluyla tahrik edilen yeni hedeflerin tanımlanmasına izin verir. Önemli olarak, protein üretimi ile ilgili hedef miRNA etkisi, genel olarak mütevazi bir translasyon baskı 15,31 <neden anlaşılmalıdır/ Sup>, miRNA düzenlemenin bir birincil rolü, protein çıkışı ince ayar gen ifadesinin anormal düzeylerde karşı koruma ve belirli programları 32,33 hücre sağlamlık sağlamak olduğunu düşündürmektedir. 3'LIFE ekranında negatif MiRNA / mRNA etkileşimlerin doğal sayıda kombine lusiferaz deneyi duyarlılığı MiRNA genlerinin bir çok sayıda hedef ince etkilerinin belirlenmesine ve gen ağlarının birden çok bileşenden tanınmasını sağlar Belirli bir miRNA 24 düzenlenir.
Burada 3'LIFE protokol açıklar ve 275 insan 3'UTRs (Şekil 1) 'in bir paneline karşı iyi karakterize edilmiş iki miRNA'lar, miR-10b ve izin-7c taranmasıyla, fizibilite olduğunu göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
3'LIFE deneyi yüksek throughput 3'UTRs fonksiyonel MiRNA hedefleri tanımlar. Bu deney, kendi ilgi miRNA için farazi hedef çok sayıda tespit etmek isteyen araştırmacılar için yararlıdır. 3'LIFE tahlil miRNA hedefleme fonksiyonel bir ölçü ve güvenle hitap edebilecek tek bir miRNA karşı 3'UTR'sinden :: tek muhabir ikili test sağlar ki 3'UTR tahrik düzenlenmesi için sorgulamak için güçlü bir yaklaşımdır Bireysel genlerin hedef durumu. Bu yaklaşımı doğrulamak için, 275 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.
Materials
| Reagents | ||
| glycylglycine | Sigma | G1127-25G |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 |
| EGTA | Sigma | E3889 |
| ATP | Sigma | FLAAS |
| DTT | Sigma | D0632 |
| MgSO4 | Sigma | M7506 |
| CoA | Sigma | C4282 |
| luciferin | Sigma | L9504 |
| NaCl | Sigma | S7653 |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 |
| BSA | Sigma | A2153 |
| NaN3 | Sigma | S2002 |
| Coelenterazine | Sigma | C3230 |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| FBS | Sigma | F2442 |
| Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 |
| Trypsin | T2600000 | |
| Consumables | ||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 |
| 96-well miniprep plate | Pall | 8032 |
| 96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 |
| 5x Lysis Buffer | Promega | E1941 |
| Instruments | ||
| 96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 |
| Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 |
| 96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 |
| Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408 (6808), 86-89 (2000).
- Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B., Bartel, D. P. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16 (13), 1616-1626 (2002).
- Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 2 (3), 219-229 (2008).
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Wienholds, E., et al. MicroRNA expression in zebrafish embryonic development. Science. 309 (5732), 310-311 (2005).
- Darnell, D. K., et al. MicroRNA expression during chick embryo development. Dev Dyn. 235 (11), 3156-3165 (2006).
- Jin, P., Alisch, R. S., Warren, S. T. RNA and microRNAs in fragile X mental retardation. Nat Cell Biol. 6 (11), 1048-1053 (2004).
- Kim, J., et al. A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neurons. Science. 317 (5842), 1220-1224 (2007).
- Poy, M. N., et al. A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion. Nature. 432 (7014), 226-230 (2004).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
- Paraskevopoulou, M. D., et al. DIANA-microT web server v5.0: service integration into miRNA functional analysis workflows. Nucleic Acids Res. 41 (Web Server issue), W169-W173 (2013).
- Krek, A., et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3’UTR. Genes Dev. 18 (2), 132-137 (2004).
- Lal, A., et al. miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2, MYC, and other cell-cycle genes via binding to ‘seedless’ 3’UTR microRNA recognition elements. Molecular Cell. 35 (5), 610-625 (2009).
- Cevec, M., Thibaudeau, C., Plavec, J. N. M. R. NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).
- Shin, C., et al. Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing. Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).
- Azzouzi, I., et al. MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis. PLoS One. 6 (7), e22838 (2011).
- Chen, J., et al. miR-193b Regulates Mcl-1 in Melanoma. Am J Pathol. 179 (5), 2162-2168 (2011).
- Chi, S. W., Hannon, G. J., Darnell, R. B. An alternative mode of microRNA target recognition. Nat Struct Mol Biol. 19 (3), 321-327 (1038).
- Jiao, L. R., et al. MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors. PLoS One. 7 (2), e32068 (2012).
- Wolter, J. M., Kotagama, K., Pierre-Bez, A. C., Firago, M., Mangone, M. 3’LIFE: a functional assay to detect miRNA targets in high-throughput. Nucleic Acids Res. , (2014).
- Mangone, M., et al. The landscape of C. elegans 3’UTRs. Science. 329 (5990), 432-435 (2010).
- Ekdahl, Y., Farahani, H. S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development. Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation. Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Zhou, P., et al. Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3’UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs. Plos One. 8 (7), e68204 (2013).
- Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis. Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).
- Seiler, C. Y., et al. DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).
- Ebert, M. S., Sharp, P. A. Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes. Cell. 149 (3), 515-524 (2012).
- Pelaez, N., Carthew, R. W. Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective. Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).
