לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

Summary

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Abstract

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

Introduction

The ability of an organism to orchestrate tissue repair processes after injury is crucial for its survival ¹. While all animals have the capacity to heal their wounds, the extent to which tissues regenerate differs greatly among species. Vertebrate species such as zebrafish, salamanders and frog tadpoles have the remarkable ability to regenerate lost tissues, including their appendages, portions of their eyes, heart, and central nervous system ^2-4. Mammalian species, such as the African spiny mouse and rabbits, are capable of regenerating holes in their pinnae ^5-7, and humans and mice regenerate portions of their liver as well as their digit tips during fetal and juvenile stages ^8-12. Although it is not well understood yet why and how certain species regenerate tissues more effectively than others, the presence of similar genetic pathways suggests that these mechanisms may lie dormant in species without great regeneration potential ^13,14. Thus elucidating tissue repair and regeneration mechanisms in species with satisfactory regeneration outcomes will benefit regeneration in humans.

We have chosen the larval zebrafish tail fin as a paradigm to demonstrate its regeneration with time-lapse brightfield stereomicroscopy. The zebrafish larval tail fin is anatomically simple as compared to the more complex adult structures, consisting of a two-layered, infolded epithelium with somatosensory axons innervating the skin that surrounds medially located mesenchymal cells ¹⁵. Despite the anatomical differences, larval tail fin regeneration is somewhat comparable to adult fin regeneration in terms of the molecular signatures and the outgrowth responses ^16,17. As compared to the adult fin, imaging larval tail fin regeneration has however several advantages: 1) larval fin regeneration is completed within just 2-3 days ¹⁶, 2) larvae can be mounted in low-melt agarose, and 3) larvae do not require feeding until ~ 5 days post fertilization (dpf) due to the presence of the yolk sac. This makes zebrafish larvae ideal for observing tissue repair dynamics in vivo.

The presented method enables the capture of detailed dynamics underlying the early processes of fin regeneration. Many studies have utilized fluorescence-based confocal microscopy to study cellular and subcellular biological processes in embryonic and larval zebrafish. Sophisticated confocal imaging setups are however often not accessible to everyone and highly expensive as compared to other imaging techniques. In contrast, the presented methodology utilizes a Discovery V12 stereomicroscope equipped with Axiovision software and a time-lapse module, thus providing a more affordable alternative to expensive imaging equipment to examine tissue behaviors. We demonstrate that this method can be utilized for imaging tissue regeneration with high temporal resolution at a minimal cost. The implications for this method could extend beyond basic biology to advance mammalian regeneration studies using organ cultures, for therapeutic development through pharmacological and genetic screens, and it can serve as a teaching tool in a classroom setting.

Protocol

דג הזברה (זן צדף) גדלה וגדלה על פי פרוטוקולים הוקמו. כל המאמצים שנעשו כדי למזער את הסבל, באמצעות 0.4 מ"מ Tricaine להרדמה ו1 מ"מ Tricaine להמתת חסד. עוברים וזחלי דג הזברה טופלו בהתאם קפדן עם תרגול חיה טוב כפי שאושרו על ידי הוועדה המתאימה (ליבת IACUC מספר בעלי חיים מעבדה הביולוגית MDI 13-20). מחקר זה אושר על ידי מכון מחקר הגנום האנושי טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה הלאומית, #-3562-01 MDIBL המוסדי Assurance תחת פרוטוקול # 14-09. הערה: הליך ההדמיה הלוכד התחדשות סנפיר דג הזברה זחל מסוכמת בצעדים הבאים: 1. גיוס של דג הזברה לשלבי הזחל לאסוף את הביצים ומניחים כ -50 ביצים לתוך צלחת 100 x 25 מ"מ פטרי המכילה 0.03% מלח אוקיינוס ​​מיידי במים ללא יונים בתוספת .00004% מתילן כחול. דגירה O / N בחממה C ° 28.5. <li> למחרת בבוקר להסיר את העוברים המתים עם טפטפת זכוכית ולשטוף את הביצים במסננת עם 0.03% מלח אוקיינוס ​​מיידי במים ללא יונים (בינוני עובר מכונה). הערה: בינונית כגון 18 Ringers, הנקס 18, E2 19, 20 E3, וDanieau מאי 21 להיות מועדף. sup> הוסף בינוני עובר טרי למאכל. אם אתם משתמשים בזני פיגמנט, לחלופין להוסיף 0.2 מ"מ 1-פניל-2-thiourea (PTU), כPTU ימנע melanogenesis וכך פיגמנטציה של הזחלים. בואו העוברים לפתח עוד יותר בחממה עד לאחר 2 ימי הפריה או כל שלב זחל רצוי אחר. 2. הכנה של לשכת ההדמיה שיטת 1: תאי הדמיה עשויים PVC או צינורות טפלון (איור 1) הערה: שיטה זו דומה לConcha ואדמס (1998) 22. לרכוש פלסטיק כיתה שתיית מים או צינורות טפלון מחנות לחומרי בניין עם חיצוני 25 מ"מקוטר פנימי של 20 מ"מ da. חותך את צינורות כדי להפוך את הטבעות של כ 10 מ"מ עובי עם אף פני השטח בכל צד. השתמש> 200 נייר זכוכית חצץ להחליק את הקצוות. נקה את הטבעות עם מים חמים ו- 70% אתנול ולתת להם אוויר יבש. עם קצה פיפטה, למרוח משחה סיליקון למחצית טבעת ולצרף את הטבעת לכיסוי זכוכית להחליק x 25 מ"מ 75 מ"מ. לחלופין, להשתמש במזרק 3 מיליליטר מלא בגריז סיליקון במקום קצה פיפטה. הערה: מאחר שקשה להכניס את גריז סיליקון לתוך מזרק 3 מיליליטר, להוסיף את שמן סיליקון למזרק 30 מיליליטר הראשון ומשתמש בזה למילוי מזרק 3 מיליליטר. שיטה 2: הכנת צלחת פטרי כחדר הדמיה. לרכוש 35 או 60 צלחות פטרי בקוטר מ"מ עם coverslip זכוכית מחובר למכסה (איור 2 א). לחלופין, כפי שמוצג באיור 3 של דיסטל & Koester (2007) 23, לקדוח פתח קטן מספיק כדי hישן coverslip לתוך המכסה של צלחת פטרי קטנה ולמרוח משחה סיליקון לבחוץ עם מזרק 3 מיליליטר. באמצעות קצה פיפטה נקי, לצרף בזהירות עגולה או מרובע coverslip של עובי רצוי למחוץ (איור 2). כדי להבטיח שagarose משמש להרכבת שהייה מחוברת היטב במהלך הליך ההדמיה, לצרף רשת פלסטיק דקה בתוך הטבעת. ראשית, לחתוך את הרשת עשויה ממסך החלון שהתקבל מחנות לחומרי בניין, לגודל של קוטר הטבעת הפנימי באמצעות מספריים בסדר עם זווית. ואז לחתוך מלבן קטן> כפול בגודל של הזחל למרכז של הרשת (איור 1, 2). החל ארבע נקודות קטנות של שומן סיליקון אינו רעיל לממשק בין להחליק את המכסה וטבעת התא (איור 1 א). שימוש במלקחיים כדי לצרף את הרשת בחוזקה לתחתית coverslip הזכוכית. 3. הרכבה והדמיה של Pre-injured זחל (שלב זה הוא אופציונאלי) הערה: שלב זה הוא מתאים להשוואות בין אורך הסנפיר נקטע ונוצר מחדש, כמטוס הקטיעה לאחר התחדשות סנפיר אינו מזוהה בזחלי דג הזברה. הכן פתרון agarose .5-1.2% נמוכים להמיס במדיום עובר לקיבוע של הדגימה. מחממים את agarose במיקרוגל ולהעביר את agarose הנוזל לתוך צינורות 1.5 מיליליטר שחממו מראש ל -42 מעלות צלזיוס בבלוק חימום. בואו agarose החם להתקרר עד 42 מעלות צלזיוס, שיכול להישמר במשך מספר שבועות בטמפרטורה זו. נסה להימנע pipetting הזחלים לתוך agarose מעל 42 מעלות צלזיוס, כמו זה יהיה לפגוע בבעלי החיים. הרדימי כמה זחלים באמצעות 10 מיליליטר של 0.4 מ"מ Tricaine (pH 7) במדיום עובר בצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ. הכן את Tricaine פי מתכוני ספר דג הזברה 18. לחלופין, השתמש 10 מיליליטר של דילול 1: 1000 99% 2-פנוקסיתנול בצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ. נקוב את הזחלים עם קצה פיפטה microloader הכתיר כדי להעריך את תגובת המגע שלהם לפני שימשיך. השתמש זחלים אינם מגיבים בלבד. העבר את הזחל אחד לפתרון agarose 42 מעלות צלזיוס באמצעות pipet פסטר זכוכית. אל תעביר את הנוזל מוגזם לagarose, אחרת agarose יהיה מדולל מדי ולא לחזק. מחק את הנוזלים שנשארו בpipet ולהעביר את הזחל עם ירידה של agarose אחד לתוך צלחת פטרי קטנה (35 או 60 מ"מ קוטר). מקם את הזחל בצד שלה להדמיה של סנפיר הזנב. אפשר agarose כדי לחזק. להעריך את agarose עם קצה פיפטה פלסטיק; טיפ יהיה לטבול את agarose אם זה נוזלי מדי. לאחר agarose יש הקרושה, שקע קטן יהיה גלוי עם נגיעה עם קצה פיפטה. בעקבות מיצוק, להוסיף פתרון Tricaine ולהמשיך לסטראו שישמש מאוחר יותר לזמן לשגות הדמיה. <br /> הערה: שלב זה עשוי גם להתבצע על ידי הנחת הזחל הרדים על צלחת פטרי מצופה agarose 1.5% במדיום עובר. השתמש stereomicroscope עם תוכנת הזמן לשגות. בחר יעד מתאים וגדלה, אשר ישמש מאוחר יותר לזמן לשגות הדמיה. כאן, להשתמש 3.5 x, עדשה אובייקטיבית מרחק עובד 16 מ"מ בסטראו. כרצוי, לנצל מיקרוסקופים חלופיים ועדשות אובייקטיביות אבל לבחור ההגדלה ראויה לתת דין והחשבון לxy-סחף פוטנציאלי וצמיחה של הסנפיר במהלך הליך ההדמיה. בחר את מצב זיהוי המצלמה במיקרוסקופ. בתוכנה, בחר את המצב "החי" כדי להציג את הזחל על המסך. פתח את החלון 'מאפייני' כדי לזהות את הבהירות באופן אוטומטי. באופן ידני לכוון את הניגודיות בבסיס טרנס תאורת מיקרוסקופ. הזז את הזחל מחוץ לשדה הראייה ובחר את תכונת תיקון הצללה כדי למזער ללא רקעISE. מקם את הזחל בחזרה לשדה הראייה ולצלם. שמור את התמונה. הסר את agarose מהזחל על ידי גירוד agarose את הראש הראשון. בדרך זו ניתן הזחל חמק מן agarose על ידי משייכתו בעדינות את הראש מagarose נותר עם קצה pipet microloader כתרים או סיכת חרקים. עם pipet פסטר זכוכית להעביר את הזחל לפתרון Tricaine טרי. 4. הקטיעה Assay הכן פתרון agarose 1.5% באמצעות מדיום עובר ויוצקים שכבה דקה לתוך צלחת פטרי. בואו agarose לחזק. תחת סטראו, למקם את צידת הזחל על agarose הקרושה ולקטוע סנפיר הזנב עם מחט מזרק G 23 עם לחץ קל (איור 3 א). 5. הרכבה זחל הדמיה זמן לשגות המשך כמתואר בצעדים 3.1-3.5 (איור 3). <li> העבר את הירידה של 0.5-1.2% agarose הנוזלי על 42 מעלות צלזיוס המכילה את הזחל לתוך טבעת חדר הדמיה (שלב 2.1), כוון את הזחל ולתת agarose לגבש. מלא את הטבעת עם פתרון Tricaine. לחלופין, אם תא צלחת פטרי (שלב 2.2) מנוצל, הר הזחל על coverslip המכסה ולמלא את המכסה עם פתרון Tricaine. כדי לאפשר ריפוי תקין פצע או התחדשות רקמות להתרחש, לגרד בזהירות את agarose המקיף את סנפיר זנב דיסטלי באמצעות קצה פיפטה microloader כתרים או סיכת חרקים. נסה לא לפגוע בסנפיר שוב ושוב (איור 3 ג). למזוג את פתרון Tricaine מכיל הוסר agarose ולמלא את הטבעת הקאמרית עם פתרון Tricaine טרי. למרוח משחה סיליקון לחלק העליון של הטבעת הקאמרית ולצרף שקופיות זכוכית x 25 מ"מ 75 מ"מ. נסה להימנע מכיסי אוויר בחדר, כפי שהם יפריעו להדמית brightfield ולייבש את הזחל לאורך זמן. אם אתם משתמשים בצלחת פטרי כחדר הדמיה, למרוח המשחה סיליקון לשפה העליונה של התא התחתון ולמלא את התא התחתון עם פתרון Tricaine. למזוג בזהירות את פתרון Tricaine במכסה והפוך את המכסה כדי לטבול את הזחל לפתרון Tricaine של החדר התחתון בזווית קלה, כדי למנוע כיסי אוויר. התא יהיה חתום בשל גריז סיליקון. הדמיה 6. זמן לשגות להרכיב תא דגירה מחומם כפי שמתואר ב23,24 (איור 4) .Place תא הדגירה סביב מיקרוסקופ ולהפעיל את החום. כוון את הטמפרטורה ל -28 מעלות צלזיוס במשך כ -10 – 20 דקות או עד שהטמפרטורה התייצבה. פתח חזית תא הדגירה המחוממת ולמקם את חדר ההדמיה על דוכן מיקרוסקופ עם coverslip פונה כלפי מעלה לכיוון המטרה. מקם את סנפיר הזחל באופן ש2/3 משדה הראייה נשאר פנוי. זה מבטיח את לכידתו שלצמיחה והתחדשות של הסנפיר במהלך הליך ההדמיה מבלי למקם את הזחל. התאם את הזחל רכוב על 28 מעלות צלזיוס במשך ~ 30 דקות לפני תחילת הקלטת הזמן לשגות, כדי למנוע שינויים בעוצמת brightfield או משמרות פוטנציאל של agarose. לחלופין, לנצל חיץ מראש חימם להתחיל הדמיה לאחר זמן הסתגלות קצר יותר. כדי להגדיר את הקלטת הזמן לשגות, לפתוח את חלון 6D רב ממדי הרכישה בתוכנת AxioVision ובחר באפשרות Z- המחסנית והזמן לשגות. אופציונאלי) בכרטיסיית Z- המחסנית וSlice המצב, בחר את העובי הפרוסה ולאחר מכן לבחור את מצב Start / Stop. הגדר את העמדה העליונה ותחתונה של הערימה. בכרטיסיית הזמן לשגות, בחר את המרווח ואת משך הזמן של הסרט ולאחר מכן להתחיל את הסרט על ידי לחיצה על לחצן התחל. מצאנו כי 30 דקות במרווחים מספיקים ומרווח זה לא להפיק נתונים מוגזמים; עם זאת shorteניתן להשתמש במרווחי r. בדקו את ממדי העמדה וZ- מחסנית בשעה הראשונה אם הזחל לא מראש מותאם. במידת צורך, לשנות את מיקום הזחל שוב אחרי יום, כמו הזחל עשוי השתנה. שמור את הקובץ בסוף הקלטת הזמן לשגות ולהמשיך בעיבוד שלאחר וquantifications באמצעות תוכנת ניתוח תמונה זמינה, כגון Imaris 25 או תמונת חבילות תוכנת הקוד הפתוח J 26 ו -27 פיג'י. ניתוח 7. נתונים קביעת אורך הסנפיר. פתח את סרט הזמן לשגות בתוכנת ההדמיה ולשמור את הקבצים בפורמט של קובץ הקניינית כדי לשפר את ביצועי תוכנה. בחר את התצוגה המאונכות להצגת חלקים בודדים כמו ערימות מוקרנות. לתיקון להיסחף, תחת תפריט פיג'י, בחר תוספים, אז רישום, ו'סחיפת 3D נכונה ". הפעולה זו תפתח חלון פיג'י ולבצע את התיקונים להיסחף. נכוןלהיסחף סיבוב בפונקצית כתמי Imaris. לחלופין, להתקין תוספי StackReg וTurboReg בתמונת J ולייבא לפיג'י. בחר אלגוריתם השינוי הרצוי בתוסף StackReg. למדידת מרחקים (למשל, קוטר פצע או אורך סנפיר), בחר באפשרות "הוסף נקודות מדידה חדשות" בסרגל הכלים השמאלי העליון. תחת 'רשימת Configure של ערכי סטטיסטיקה גלויה' בתפריט השמאלי התחתון, בחר את ערכי הסטטיסטיקה שיוצגו. ב'מצב הקו 'תחת לשונית ההגדרות בחרו' זוגות (AB, CD …) ". ב'תוויות מאפיינים '' שם 'בחר ו'מרחק', כדי להציג את המרחק בין שני נקודות A ו- B בסמוך לקו המדידה. מעבר למצב 'ערוך' והחזק את לחצן השינוי כדי לבחור את הנקודה הראשונה בסוף notochord. לאחר מכן השתמשתי באותה התצורה כדי לבחור את הנקודה השנייה בשוליים סנפיר דיסטלי. תחת הלשונית 'הנתונים סטטיסטיים', בחר בלחץ הדיסק (יצוא כל) בפינה הימנית התחתונה כדי להציג ולייצא את המרחק בתמונה. חזור על המדידות בזמנים שנבחרו על ידי הזזת המחוון מתחת לתמונה בצד הימין. במקום ליצור נקודות מדידה חדשות, ניתן למקמו מחדש הקודם על ידי הבחירה ראשונה הנקודה עם הכפתור השמאלי של העכבר, ואז בו זמנית לחיצה על Shift ועל הכפתור השמאלי של העכבר במיקום החדש. לחלופין לאפשרות מדידת נקודות, לנצל את הצופה הפרוסה למדידת מרחקים. במצב התצוגה הפרוסה, גלול למיקום רצוי ולחץ על המיקום הראשון והשני עם לחצן העכבר השמאלי. המרחק יוצג. אפשרות זו עם זאת, אינה מאפשרת יצוא נתונים. קביעת אורך סנפיר ואזור בImageJ. פתח את סרט הזמן לשגות בImageJ באמצעות תוסף שמזהה את פורמט קובץ .zvi. לחלופין, טען בQuקובץ ickTime או רצף TIFF. הערה: אם אתה משתמש בפורמט קובץ TIFF דחוס, מידות התמונה לא צריכה להיות מוגדרות. אם פתיחת קובץ בפורמט שונה ללא מידע הקובץ, בחר 'קנה מידה בהגדרה' תחת התפריט 'לנתח' לקודם להגדיר את מרחק התמונה ויחידה. ב'תפריט הגדרת Scale ', הסוג ב' המרחק בפיקסלים ', להלן סוג ב' המרחק הידוע 'לערך פיקסל (ניתן להשיג זאת על ידי מדידת מספר הפיקסלים בסרגל קנה מידה שנוסף לתמונה , לאחר מכן לחץ על למדוד כדי לקבל את התוצאה), ו'היחידה של אורך '(' מיקרומטר 'בדרך כלל). לאחר מכן לחץ על OK. למדידות סנפיר אזור בחרו את כלי 'בחירת Freehand' בסרגל הכלים ולהתוות את אזור הסנפיר על ידי לחיצה על לחצן העכבר השמאלי לחוץ בזמן הציור לאורך קו המתאר של הסנפיר. עבור מדידות אורך סנפיר, בחר בכלי הקו "ישר" ולמתוח קו בין הנקודות הרצויות להיותנמדד. לחץ על האפשרות 'מדוד' תחת 'לנתח' כדי להציג את האזור ואורכו של הסנפיר. חזור על פעולה זו לעתים קרובות ככל הדרוש לנקודות זמן מרובות של הסרט. שימוש בסטטיסטיקת תוכנת נתונים יכולים להיות מוצג באופן גרפי.

Representative Results

הטכניקה המוצגת הינה מתאימה על מנת להבהיר את דינמיקת תיקון רקמות בתגובה לקטיעה. הסרט מוכיח כי קטיעת הסנפיר תחילה מפעילה השפעת ארנק מיתרים, מאופיינת בהתכווצויות באמצעות כבלים יקטינו שרירן שנמצאים בסנפיר פי 28 (איור 5, B). במקביל, תאים נמתחים מהפצע (ראה סרט). ההתכווצות ייתכן אפוא שאמצעי לגרש תאים שסביר להניח שנועדו לעבור מוות של תאים. התוצאות שלנו מראות עוד כי הצמיחה ההתפתחותי של הזחל מתרחשת באופן עצמאי של התחדשות (סרט), ואילו התחדשות סנפיר אינה יוזמת עד שלאחר קטיעה כ -14 שעות, כפי שנמדדה על ידי אורך סנפיר ואזור במהלך 36 שעות הזמן הבא קטיעה (איור 5 ג , D). צמיחת סנפיר משובי הכוללת לאחר 1.5 ימים הייתה כ -60% מאורך הסנפיר המקורי (איור 5E). יחדיו, תוצאות אלה ממחישות כי tr הקטיעה iggers התכווצות סנפיר, שחול של תאים מהפצע, ותגובת משובי מתעכבים באופן זמני. בעוד תאי extruded הם צפויים עתידים לעבור מוות של תאים, הטבע של תאים אלה צריך להיות מובהרים נוספים. קאמרי הרכבה טבעת 1. הדמיה איור () מוצג הינה טבעת פלסטיק שמחוברת לcoverslip עם גריז סיליקון. רשת פלסטיק מצורף לחלק הפנימי של החדר עם ארבע נקודות קטנות של שומן סיליקון. (ב) התא המכיל את הזחל רכוב מלא בפתרון Tricaine ושקופיות זכוכית מחוברת לחלק העליון. (C) רכוב זחל בן יומו 2 (חץ) מוצג בהגדלה גבוהה יותר כדי לתאר את גודלו ביחס לרשת."_blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2. קאמרי הדמיה עשה הרכבה מצלחות פטרי. () מוצג הינה צלחת זכוכית מסחרית זכוכית העליונה תחתונה פטרי עם רשת פלסטיק המצורפת לcoverslip הזכוכית. (ב) המוצג הנו קאמרי צלחת פטרי בהקמה עצמית עם חור שנקדח לתוך המכסה וcoverslip המצורף מבחוץ עם גריז סיליקון. הרשת והזחל הם רכובים בתוך החדר המכיל פתרון Tricaine. לאטום את החדר, גריז סיליקון מוחל על השפה העליונה, החיצונית של התא התחתון והמכסה העליון המצורף. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <i alt מ"ג = "איור 3" src = "/ קבצים / ftp_upload / 52,654 / 52654fig3.jpg" /> איור 3. תכנית של קטיעה והרכבה של זחל להדמיה. (א) לקטיעה, למקם את הזחל הרדים על צלחת פטרי מצופה agarose ולקטוע סנפיר הזנב עם מחט מזרק. (ב) להרכבה, להעביר את הזחל עם טפטפת העברה לתוך צינור 1.5 מיליליטר מלא 42 ° C agarose הנוזלי ופיפטה ירידה המכילה את הזחל לחדר ההדמיה, כוון את הדגים ולכסות את הקרושה agarose עם מדיום עובר. (C) תגרד את agarose מסנפיר הזנב באמצעות קצה תרי microloader פיפטה או כלי דומה ולהחליף בינוני עובר עם מדיום חדש. תמונה (D) סנפיר הזנב תחת סטראו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "תמיד"> איור 4. תא דגירה מחומם נבנה עצמית. (AC) המוצג הנו תא דגירה מחומם מקרטון, פלסטיק הבועות וסקוטש. דוד קווי כיפה (שנועד במקור לדגירת עוף) מחובר לתא באמצעות קלטת אלומיניום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 5. דינמיקת התחדשות Fin. () תכנית של שיטת assay הקטיעה וכימות סנפיר זנב מנוצל כדי לקבוע את אורך הסנפיר (חץ אדום) ואזור (קווי המתאר אדומים של הסנפיר). קטיעת סנפיר זנב (ב) בתחילה מעוררת התכווצות של הסנפיר, ואחריו Regeתולדת רקמת nerative. הסנפיר גם עובר צמיחה התפתחותית, כפי שמעיד עליית גודל הרוחב. (C) המוצג הנו אורך הסנפיר כפונקציה של זמן, חושף התחלת צמיחת משובי ליניארי ב ~ 14 hPa. (ד) כימות של אזור הסנפיר חושפת לראשונה ירידה בגודל, שניתן לייחס להתכווצות של הסנפיר. אחרי ~ 14 שעות, מגדילה גודל הסנפיר בקצב ליניארי. (E) השוואה של אורך הסנפיר לפני הקטיעה ואחרי 36 שעות תערוכות ~ 60% לצמיחה מחודשת. בר סולם: 100 מיקרומטר קיצורים: קדם-מגבר, לפני קטיעה; שעות שלאחר קטיעה, hPa; regen, התחדשות; מגבר, קטיעה אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. סרט. התחדשות סנפיר במהלך 36 הזמןhr. מוצג הוא סנפיר זנב של זחל ישן 2.5 יום במהלך ההתחדשות. צמיחת משובי שלאחר קטיעת 30 דקות החל היא הדמיה ב -30 דקות במרווחים על סטראו באמצעות עדשה אובייקטיבית 3.5x.

Discussion

השיטה המוצגת מאפשרת התבוננות ריפוי פצעים והתחדשות רקמות בחיים זחלי דג הזברה עם in vivo הדמיה הזמן לשגות בסטראו brightfield, באמצעות הגדרה פשוטה יחסית. הליך זה מחייב היבטים מסוימים חשובים שצריכים לבדוק, אשר יהיה לייעל את התוצאה: 1) ריכוזי agarose נמוכים (~ 0.5%) יהיה הפחתת חסמי צמיחה של דג הזברה הזחל גדל ללא הרף, 2) הסרת agarose סביב הסנפיר חשובה לא כדי לטשטש את תהליך הריפוי, 3) לכידת agarose ברשת פלסטיק שומרת לעצמה את agarose ובעלי חיים במצב יציב לאורך כל ההליך, ו- 4) שליטה בסביבת טמפרטורה נכונה, שהוא חיוני לקיום זחל. יש לנו להתאים מחומם חדר דגירה ^23,24, אשר מנצל אריזת בועות שהודבקה על גבי קרטון, ודוד כיפת קווי לשלוט על הטמפרטורה וזרימת אוויר נאותה עם תנודות מינימליות במהלךהליך הדמיה. ניתן להכין חדר פשוט וחסכוני זה כדי להתאים לכל מיקרוסקופ. תא דגירה מחוממת דומה כבר מנוצל גם לעכברי הדמיה ופיתוח חומוס ^24,29.

אנו מציעים כי זחלים-קטוע מראש הם רכובים על תמונה שלפני קטיעה, demounted לקטיעה, ושב ורכב לזמן לשגות הדמיה. למרות שזה אפשרי על מנת לבצע את הפעולות הבאות בשלב אחד בחדר ההדמיה הסופי, בניסיון שלנו מצאנו כי קטיעת סנפיר הזנב על coverslip זכוכית אינה אופטימלית, כפי שהוא קורע את הרקמה ולא לגרום לחתך נקי. שיטת הקטיעה מבוססת agarose באמצעות מחט מזרק תוארה במקור על ידי Kawakami ועמיתיו (2004) ^16, והוא גם, בניסיון שלנו, אידיאלי לבצע קטיעות. כך, הסדרה די המסובכת של צעדים שהצגנו היא גם מוצדקת ומבטיחה תוצאת התחדשות אופטימלית.

הראינו larv שדג הזברה אל ב -2 DPF ניתן הדמיה עד 1.5 ימים בagarose ופתרון Tricaine. אנו משמשים פתרון מותאם pH Tricaine (pH7) מוכן עם מלח אוקיינוס ​​מיידי, שאינו מפריע לבריאותו של הדגימה לתקופה ההדמיה הוצגה. אנחנו בעבר אך גם הוכיחו כי באמצעות Tricaine במדיום Danieau מאפשר זמן לשגות הדמיה של 2.5 DPF דג הזברה זחל על מיקרוסקופ confocal לפחות 2 ימים ^30. לפיכך, תנאי חיץ אופטימליים יכולים להאריך בריאות זחל והאורך של הדמיה. לחלופין, ריכוזים נמוכים Tricaine עשויים לשמש להרדמה, או 2-פנוקסיתנול, שבו מצאו נסבל היטב בשלבי זחל ומבוגרים בגיל 28 מעלות צלזיוס במשך לפחות 60 שעות.

כדי להימנע מפגמים בהתחדשות סנפיר, ואנחנו פינינו את agarose מסנפיר הזנב לפני ההדמיה. הנתונים שלנו מראה כי בתוך 1.5 ימים הסנפיר כבר התאחה לכ -60%. קצב התחדשות זו עולה בקנה אחד עם מחקר קודם הגדרת 3 ימיםזה זמן ממוצע להתחדשות סנפיר זנב בדג זברה זחלים עד 6 DPF ^16. שיטות אלטרנטיביות לagarose אולם יכולות להיות מנוצלת כדי לעלות את הדג להדמיה. לדוגמא, דקה פלזמה קרישי ³¹ או פרופילן אתילן פלואור (FEP) צינורות מצופים בmethylcellulose ומלא בריכוזים נמוכים מאוד agarose (0.1%) היה מומלץ למיקרוסקופיה גיליון אור ³² ועשויה להיות מתאים לשיטה שלנו שהוצגה. עם זאת, אנו לא ממליצים agarose methylcellulose ושל 0.1%, כפי שהם דורשים כי הדגימה הם רכובים בחלק התחתון של התא בשל חוסר המיצוק של תקשורת אלה. ריכוזים גבוהים מאוד של methylcellulose יתר על כן יפיקו כיסי אוויר המבוססים על הניסיון שלנו, ואלה עלולים להפריע להליך ההדמיה. אם תקשורת אלה העדיפו בשימוש בתא התחתון, חשוב שמרחק עבודה מתאים בין העדשה האובייקטיבית והדגימה הוא הווה. יש לציין כי מ 'ethylcellulose כמדיום הרכבה מומלצת רק לתקופה של עד היום 1, כפי שהוא עלול להפריע לבריאות זחל ^32.

ההרכבה הדגימה במכסה עלולה לגרום לסחף כלפי מטה הכבידה איטי. לכן מומלץ לחלקים מרובים תמונה בכל נקודת זמן, אשר גם יכול להיות מוקרנת למטוס בודד או רק תמונות שנמצאות במישור המוקד ניתן חילוץ להרכבת הסרט הסופי. הדמיה הדגימה בתא התחתון יכולה להיות מתודולוגיה חלופית, כדי למנוע סחף כלפי מטה פוטנציאלי. קרישי פלזמה יכולים להיות שימושיים כדי למנוע סחף, כמו הפלזמה תדבק השכבה העוטפת החיצונית (EVL, periderm) ^31, ולכן עשוי לייצב את הדגימה. אולם זה צריך להיבדק, כמו גם איך דג הזברה זחל ארוך יכול להישמר בקרישי פלזמה מבלי להפריע לבריאות זחל או התחדשות סנפיר.

הסרט שלנו הורכב ניצול חלקים בודדים (26 מיקרומטר)של Z- מחסנית נרשמה, שכיסה את העובי המלא של הסנפיר (~ 10 מיקרומטר) ואשר היווה z-סחף פוטנציאלי של הסנפיר במהלך הליך ההדמיה. על מנת לשמור על מידע 3-D, אפשר גם להקרין Z- ערימות לתמונות בודדות. כי זה עלול לגרום לטשטוש של התמונה, deconvolution brightfield עשויה להיות רצויה. תוכנה, כגון Deconvolve או X3 Autoquant יכולה להיות מנוצלת למטרה זו. לחלופין, אלגוריתמים מתמטיים (שתוארו בTadrous ³³⁾ יכולים להיות מיושמים להשגת פונקצית נקודת התפשטות יחס גבוה אות לרעש (SNR). קבלת יחס אות לרעש גבוהה מייצגת את אחד המכשולים העיקריים בdeconvolution brightfield. למרות ששיטה זו דורשת ניגודיות גבוהה ועובי מדגם דק, זה יהיה מתאים להדמיה של סנפיר הזנב בשל הרוחב המוקטן שלה.

יתרון ברור של שיטת ההדמיה שהוצגה הוא שזה במהירות להתאמה לכל סטראו מצויד במצלמת CCDתוכנת הזמן לשגות ד ומציעה אלטרנטיבה בעלות נמוכה למערכות הדמיה confocal יקרות יותר. בעוד ששיטה זו לא לנצל הקרינה לגילוי תאים, ניתן להאריכה ליישומים כאלה על ידי ניצול מערכת אוטומטית לשליטת תריס ותוכנת deconvolution הודעה ^{הדמיה-34.} זה יאפשר למשתמשים לצפות בתהליכי תיקון נוסף פצע והתחדשות עם תא בודד או רזולוציה subcellular על פני תקופות זמן ארוכות יותר.

הבהירות האופטית והקלות בה עוברי ודג זברה זחל יכולה להיות מטופלים, ואת יכולת ההתאמה של שיטה זו לכל סטראו הופכת אותו מתאימה להוראת ביולוגיה חוליות בסיסית במסגרת כיתתית. בשיטה זו ניתן להקנות לתלמידי הבנה טובה יותר של התהליכים הביולוגיים הבסיסיים שבבסיס תיקון והתחדשות רקמות. תהליכים ביולוגיים אחרים שכבר נתפסו עם שיטה דומה הם פיתוח דג הזברה עוברי ^23,34 ולבפונקציה (לא פורסם). שיטה זו מציעה גם את האפשרות לתיקון פצע ניטור והתחדשות בזחלים שכבר מניפולציות גנטית ופרמקולוגית.

Materials

Reagents
Bullseye Agarose (MidSci, Cat. No. BE-GCA500)
Low-melt agarose (Fisher BioReagents, Cat No. BP1360-100)
1-phenyl-2-thiourea [Alfa Aesar, Cat No. L06690]
Instant Ocean Aquarium Salt (Pet store)
Methylene Blue (0.1% solution) (Sigma, Cat. No. M9140)
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Sigma-Aldrich, Cat. No. E10505)
2-Phenoxyethanol (Sigma-Aldrich, Cat. No. 77699)
Petri Dish 35 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351008)
Petri Dish 60 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351007)
Petri Dish 100 x 25 mm (BD Falcon, Cat. No 351013)
5.75 inch boroschillate glass pipets (Fisher)
35 mm Glass Top Glass Bottom Dish (MatTek Corporation, Cat No. D35-20-0-TOP) Glass: 0.085-0.115mm
Superfrost/Plus microscope slides (Fisherbrand, Cat No. 12-550-15)
Glass coverslips (Electron Microscopy Services, Cat No. 72191-75)
Glass coverslips (Warner Instruments, Cat. No. CS-18R15)
Phifer Phiferglass Insect Screen Charcoal – 48" (Home Depot)
DOW CORNING® HIGH VACUUM GREASE
Microloader pipette tips 20 µl (Eppendorf, Cat. No. 930001007)
Fine Scissors – Sharply Angled Up (Fine Science Tools, Cat. No. 14037-10)
3 mL Luer-Lok™ disposable syringe (BD, Cat. No. 309657)
60 mL Luer-Lok™ disposable syringe (BD, Cat. No. 309653)
23-gauge syringe needles (BD, Cat. No. 305145)
Dumont #5 Forceps (Fine Science Tools, Cat. No. 11295-00)
Equipment
LabDoctor Mini Dry Bath (MidSci)
Zeiss Discovery.V12 compound microscope
Zeiss Plan Apo S 3.5X objective
Zeiss AxioCam MRm
Zeiss Axiovision software, Release 4.8.2SP1 (12-2011)