Fange Tissue Repair i Sebrafisk Larver med Time-lapse Lysfelt stereomikros

Summary

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Abstract

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

Introduction

The ability of an organism to orchestrate tissue repair processes after injury is crucial for its survival ¹. While all animals have the capacity to heal their wounds, the extent to which tissues regenerate differs greatly among species. Vertebrate species such as zebrafish, salamanders and frog tadpoles have the remarkable ability to regenerate lost tissues, including their appendages, portions of their eyes, heart, and central nervous system ^2-4. Mammalian species, such as the African spiny mouse and rabbits, are capable of regenerating holes in their pinnae ^5-7, and humans and mice regenerate portions of their liver as well as their digit tips during fetal and juvenile stages ^8-12. Although it is not well understood yet why and how certain species regenerate tissues more effectively than others, the presence of similar genetic pathways suggests that these mechanisms may lie dormant in species without great regeneration potential ^13,14. Thus elucidating tissue repair and regeneration mechanisms in species with satisfactory regeneration outcomes will benefit regeneration in humans.

We have chosen the larval zebrafish tail fin as a paradigm to demonstrate its regeneration with time-lapse brightfield stereomicroscopy. The zebrafish larval tail fin is anatomically simple as compared to the more complex adult structures, consisting of a two-layered, infolded epithelium with somatosensory axons innervating the skin that surrounds medially located mesenchymal cells ¹⁵. Despite the anatomical differences, larval tail fin regeneration is somewhat comparable to adult fin regeneration in terms of the molecular signatures and the outgrowth responses ^16,17. As compared to the adult fin, imaging larval tail fin regeneration has however several advantages: 1) larval fin regeneration is completed within just 2-3 days ¹⁶, 2) larvae can be mounted in low-melt agarose, and 3) larvae do not require feeding until ~ 5 days post fertilization (dpf) due to the presence of the yolk sac. This makes zebrafish larvae ideal for observing tissue repair dynamics in vivo.

The presented method enables the capture of detailed dynamics underlying the early processes of fin regeneration. Many studies have utilized fluorescence-based confocal microscopy to study cellular and subcellular biological processes in embryonic and larval zebrafish. Sophisticated confocal imaging setups are however often not accessible to everyone and highly expensive as compared to other imaging techniques. In contrast, the presented methodology utilizes a Discovery V12 stereomicroscope equipped with Axiovision software and a time-lapse module, thus providing a more affordable alternative to expensive imaging equipment to examine tissue behaviors. We demonstrate that this method can be utilized for imaging tissue regeneration with high temporal resolution at a minimal cost. The implications for this method could extend beyond basic biology to advance mammalian regeneration studies using organ cultures, for therapeutic development through pharmacological and genetic screens, and it can serve as a teaching tool in a classroom setting.

Protocol

Sebrafisk (Nacre stamme) ble avlet og oppvokst i henhold til etablerte protokoller. Alle forsøk ble gjort for å minimere lidelse, ved hjelp av 0,4 mm Tricaine for anestesi og 1 mM Tricaine for aktiv dødshjelp. Sebrafisk embryo og larver ble håndtert i henhold til god dyr praksis som er godkjent av den aktuelle komiteen (MDI Biological Laboratory dyr kjerne IACUC nummer 13-20). Denne studien ble godkjent av National Human Genome Research Institute Animal Care og bruk komité, MDIBL Institutional Assurance # A-3562-01 etter protokoll # 14-09. Merk: Bilde prosedyre som fanger fin regenerering i larvesebrafisk er oppsummert i følgende trinn: 1. Heving av Sebrafisk til larvestadier Samle inn egg og legg ca 50 egg i en 100 x 25 mm petriskål som inneholder 0,03% Instant Ocean salt i avionisert vann supplert med 0,00004% metylenblått. Ruge O / N i en 28.5 ° C inkubator. <li> Neste morgen fjerne de døde fostre med et glass pipette og skyll eggene i en sil med 0,03% Instant Ocean salt i avionisert vann (kalt embryo medium). Merk: Medium som Ringers 18, Hanks 18, E2 19 E3 20 og Danieau 21 være foretrukket. sup> Legg til frisk embryo medium til parabolen. Ved hjelp av pigmenterte stammer, eventuelt legge 0,2 mM 1-fenyl-2-tiourea (PTU), som PTU vil hindre melanogenese og dermed pigmentering av larvene. La embryoene videreutvikle i inkubatoren inntil to dager etter befruktning, eller en hvilken som helst annen ønsket larvestadiet. 2. Utarbeidelse av Imaging Chamber Metode 1: Imaging kamre laget av PVC eller Teflon rør (figur 1) Merk: Denne metoden er lik Concha og Adams (1998) 22. Erverve drikkevann grade plast eller Teflon slange fra en jernvarehandel med en 25 mm ytre enda 20 mm indre diameter. Kutte røret for å gjøre ringer av omtrent 10 mm tykkelse med en jevn overflate på begge sider. Bruk> 200 sandpapir for å jevne ut kantene. Rengjør ringer med varmt vann og 70% etanol og la dem lufttørke. Med en pipette, påfør silikonfett til halvparten av en ring og fest ringen til en 75 mm x 25 mm glassdekselstrimmel. Alternativt kan du bruke en 3 ml sprøyte fylt med silikonfett i stedet for en pipette. Merk: Fordi det er vanskelig å sette silikonfett inn i 3 ml sprøyte, tilsett silikonfett på en 30 ml sprøyte først og bruker dette for å fylle 3 ml sprøyte. Metode 2: Fremstilling av en petriskål som et avbildningskammeret. Erverve 35 eller 60 mm diameter Petri-skåler med et dekkglass festet til lokket (figur 2A). Alternativt, som vist i figur 3 av Distel & Koester (2007) 23, bore en åpning som er liten nok til å hgammel en dekkglass i lokket på en liten petriskål og bruke silikonfett på utsiden med en 3 ml sprøyte. Ved hjelp av en ren pipette, feste en rund eller firkantet dekk av ønsket tykkelse på utsiden (figur 2B) nøye. For å sikre at agarose som benyttes for montering forblir fast festet i avbildningsprosedyren, feste en fin plastnett inne i ringen. Først skjæres mesh laget av vindusskjerm oppnådd fra en jernvarehandelen, i størrelsen av den indre ringdiameter ved hjelp av fin saks med en vinkel. Deretter skjæres et lite rektangel> to ganger størrelsen av larven inn i midten av nettet (figur 1, 2). Anvende fire små punkter av ikke-toksiske silikonfett på grenseflaten mellom dekkglass og kammerringen (figur 1A). Bruk tang for å feste maske fast til bunnen av glass dekkglass. 3. Montering og Imaging av Pre-injfigurert Larva (Dette trinnet er valgfritt) Merk: Dette trinnet er egnet for sammenligninger mellom den amputerte og regenerert fin lengde, som amputasjon flyet etter fin regenerering er ikke gjenkjennelig i sebrafisk larver. Forberede en 0,5 til 1,2% lavt smelte agarose løsning i embryo medium for immobilisering av prøven. Varm agarose i en mikrobølgeovn og overføre det flytende agarose i 1,5 ml rør som er forvarmet til 42 ° C i en varmeblokk. La varm agarose avkjøles til 42 ° C, som kan opprettholdes i flere uker ved denne temperatur. Prøv å unngå å pipettere larvene inn agarose over 42 ° C, da dette vil være skadelig for dyrene. Bedøve flere larver ved hjelp av 10 ml av 0,4 mM Tricaine (pH 7) i embryo medium i en 60 mm diameter petriskål. Klargjør Tricaine henhold til sebrafisk Bestill Oppskrifter 18. Alternativt kan bruke 10 ml av en 1: 1000 fortynning av 99% 2-fenoksyetanol i en 60 mm diameter petriskål. Poke larvene med en avkortet microloader pipette for å vurdere deres touch respons før du fortsetter. Bruk kun ikke-responsive larver. Overfør en larve i den 42 ° C agarose løsning ved anvendelse av en glass Pasteur-pipette. Ikke overføre dreven væske inn i agarose, ellers agarose blir også fortynnet og ikke stivner. Kast den gjenværende væske fra pipette og overføre larven med en dråpe av agarose i en liten petriskål (35 eller 60 mm diameter). Plasser larve på sin side for avbildning av halefinnen. Tillat agarose å stivne. Vurdere agarose med en plast pipette tips; spissen vil senke det i agarosen hvis den er for flytende. Når agarosen har størknet, vil en liten innrykk være synlig ved å berøre med en pipette. Etter størkning, legge Tricaine løsning og gå videre til stereo som skal brukes senere for time-lapse bildebehandling. <br /> Merk: Dette trinn kan også utføres ved å plassere en bedøvet larve på en petriskål belagt med 1,5% agarose i embryo medium. Bruk en stereomikroskop med time-lapse programvare. Velg et passende objektiv og forstørrelse, som vil bli brukt senere for time-lapse bildebehandling. Her bruker en 3,5 x, 16 mm arbeidsavstand objektiv på et stereomikroskop. Som ønsket, utnytte alternative mikroskoper og objektiv, men velger en skikkelig forstørrelse å gjøre rede for potensiell xy-drift og vekst av finnen under bildebehandling prosedyren. Velg kameradeteksjon modus på mikroskopet. I programvaren velger du "live" modus, for å vise larven på skjermen. Åpne 'Properties' vinduet for å automatisk registrere lysstyrken. Justere kontrasten på mikroskop trans-belysning basen manuelt. Flytt larven ut av synsfeltet og velg Shading Correction-funksjonen for å minimere bakgrunns neiise. Plasser larve tilbake i synsfeltet og ta et øyeblikksbilde. Lagre bildet. Ta av agarose fra larven ved først å skrape agarosen av hodet. Denne måten larven kan gled ut av agarose ved å trekke forsiktig hodet vekk fra den gjenværende agarose med en avkortet microloader pipette tips eller et insekt pin. Med et glass Pasteur pipette overføre larven til frisk Tricaine løsning. 4. Amputasjon analysen Forberede en 1,5% agarose løsning med embryo medium og hell et tynt lag i en petriskål. La agarose stivne. Under en stereomikroskop, plasserer larven sideveis på størknet agarose og amputere halefinnen med en 23 G sprøyte nål med et lett trykk (figur 3A). 5. Montering av Larva for Time-lapse Imaging Fortsett som beskrevet i trinn 3.1 til 3.5 (Figur 3B). <li> Overfør en dråpe av 0,5 til 1,2% agarose flytende ved 42 ° C inneholdende larven inn i avbildningskammeret ringen (trinn 2.1), orientere larven og la den stivne agarose. Fyll ringen med Tricaine løsning. Alternativt, hvis petriskål kammeret (trinn 2.2) er utnyttet, montere larven på lokket dekkglass og fylle lokket med Tricaine løsning. For å sikre tilstrekkelig sårtilheling eller vev regenerering å skje, forsiktig skrape av agarose rundt distal halefinnen ved hjelp av en avkortet microloader pipette eller et insekt pin. Prøv å ikke skade finnen flere ganger (Figur 3C). Dekanter Tricaine oppløsning inneholdende det fjernede agarose og fylle kammeret ring med frisk Tricaine løsning. Påfør silikonfett til toppen av kammeret ring og fest en 75 mm x 25 mm glass lysbilde. Prøv å unngå luftlommer i kammeret, som de vil forstyrre lysfelt bildebehandling og desiccate larven over tid. Hvis du bruker en petriskål somen avbildning kammer, gjelder silikonfett på den øvre kant av bunnkammeret og fyller den nederste kammer med Tricaine løsning. Decant nøye Tricaine løsning i lokket og vri lokket over til fordype larven inn i Tricaine løsning av bunnkammeret i en liten vinkel for å unngå luftlommer. Kammeret blir forseglet på grunn av silikonfett. 6. Time-lapse Imaging Montere et oppvarmet inkubasjon kammer som beskrevet i 23,24 (figur 4) .Sett inkubasjonstiden kammeret rundt mikroskopet og slå på varmen. Juster temperaturen til 28 ° C i ca 10 – 20 minutter eller inntil temperaturen har stabilisert seg. Åpne fronten av den oppvarmede inkubering kammeret og plassere avbildningskammeret på mikroskopstativet med dekkglasset vender oppover mot målet. Plasser larvefinnen på en måte at 2/3 av synsfeltet forblir ledig. Dette sørger for fangst avvekst og regenerering av finnen i løpet av bilde prosedyre uten å måtte omplassere larven. Juster montert larve til 28 ° C i ~ 30 min før start av intervallopptak for å unngå endringer i lysfelt intensitet eller potensielle skift av agarose. Alternativt bruke forvarmet buffer for å starte bilde etter kortere tid justering. Slik setter du opp intervallopptak, åpner 6D flerdimensjonale Acquisition vindu i Axiovision programvare og velger z-stack og time-lapse alternativet. Valgfritt) I kategorien z-stack og Slice Mode, velg skive tykkelse og velg Start / Stopp-modus da. Definerer den øvre og nedre stilling i stabelen. I kategorien time-lapse, velge intervallet og varigheten av filmen og deretter starte filmen ved å trykke på startknappen. Vi har funnet at 30 minutters intervaller er tilstrekkelig, og dette intervallet ikke genererer dreven data; men shorter intervaller kan brukes. Sjekk posisjons- og z-stack dimensjoner i løpet av den første timen dersom larven ikke var forhåndsjustert. Om nødvendig omplassere larve igjen etter en dag, som larven kan ha forskjøvet. Lagre filen på slutten av intervallopptak og fortsette med etterbehandling og kvantifisering ved hjelp av tilgjengelig programvare for bildeanalyse, for eksempel Imaris 25 eller åpen kildekode programvarepakker Bilde J 26 og Fiji 27. 7. Data Analysis Bestemme fin lengde. Åpne time-lapse film i bildebehandlingsprogrammer og lagre filene i den proprietære filformat for å forbedre programvare ytelse. Velg den ortogonale visningen for å vise individuelle seksjoner som projiserte stabler. For korreksjon av drifting, under Fiji-menyen, velg Plugins, deretter Registrering, og 'Korrekt 3D-drift ". Dette vil åpne et Fiji vindu og utføre drift korreksjoner. Riktigrotasjons drift i Imaris Spots funksjon. Alternativt installere StackReg og TurboReg plugins i bilde J og importere til Fiji. Velg ønsket transformasjon algoritmen i StackReg plugin. Å måle avstander (f.eks sår diameter eller fin lengde), velg "Legg til nye målepunkter 'alternativet i øvre venstre verktøylinjen. Under "Konfigurer listen over synlige Statistikk Verdier" i nedre venstre menyen, velg statistikk verdier som skal vises. I "linjemodus" under fanen innstillinger velge 'Pairs (AB, CD …)'. I "Etiketter Properties 'velger' Navn 'og' Avstand", for å vise avstanden mellom punktene A og B ved siden av målelinjen. Bytte til "Rediger" modus og hold nede shift-knappen for å velge det første punktet på slutten av ryggstreng. Deretter bruker samme konfigurasjon for å velge det andre punktet på distal fin margin. Under Statistikk-fanen, velg disken knappen (Export All) nederst til høyre for å vise og eksportere avstand i bildet. Gjenta målinger på utvalgte tider ved å flytte glidebryteren under bildet til høyre. I stedet for å lage nye målepunkter, kan de forrige flyttes ved først å velge punkt med venstre museknapp, deretter samtidig trykke shift og venstre museknapp på den nye posisjonen. Alternativt til målepunktene alternativet, utnytte skive betrakteren til å måle avstander. I stykket view-modus, bla til ønsket posisjon og klikk på den første og andre posisjon med venstre museknapp. Avstanden vil bli vist. Dette alternativet er imidlertid ikke tillater eksport av data. Bestemme fin lengde og areal i ImageJ. Åpne time-lapse film i ImageJ ved hjelp av en plugin som gjenkjenner .zvi filformat. Alternativt, legger i en QuickTime fil eller tiff sekvens. Merk: Hvis du bruker en ukomprimert tiff-fil format, gjør bildet dimensjoner ikke må spesifiseres. Hvis du åpner et annet filformat uten filinformasjonen, velg "Sett Scale" under "Analyser" menyen for å først definere bilde avstand og enhet. I "Sett Scale meny", skriv inn "Avstand i piksler ', under type i' kjent avstand 'for pikselverdien (dette kan oppnås ved å måle antall piksler på en skala bar som ble lagt til bildet Klikk deretter Mål for å få resultatet), og "Enhet for avstand (typisk mikrometer). Klikk deretter på OK. For finn målinger området velg "Freehand Selection" verktøy på verktøylinjen og skissere fin området ved å holde venstre museknapp nede mens du tegner langs omrisset av finnen. For finnelengdemålinger, velg "Straight" linje verktøy og trekke en linje mellom de ønskede punkter for å væremålt. Klikk på "Measure 'alternativ under" Analyser "for å vise området og lengden på finnen. Gjenta dette trinnet så ofte som nødvendig for flere tidspunkter av filmen. Ved hjelp av statistikk programvare kan dataene grafisk.

Representative Results

Den presenterte teknikk er egnet til å belyse vevsreparasjon dynamikken i respons til amputasjon. Filmen viser at amputasjon av finnen innledningsvis utløser en pung-streng effekt, karakterisert ved kontraksjoner via aktin-myosin kabler som er tilstede i den fin-fold 28 (figur 5 A, B). Samtidig, blir cellene ekstrudert fra såret (se film). Sammentrekning kan således være et middel for å utvise celler som er sannsynlig bestemt til å gjennomgå celledød. Våre resultater viser videre at utviklings vekst av larven oppstår uavhengig av regenerering (film), mens finnen regenerering ikke starte før om 14 timer etter amputasjon målt ved fin lengde og området over tid løpet av 36 timer etter amputasjon (figur 5C , D). Den totale regenerative finne vekst etter 1,5 dager, var omtrent 60% av den opprinnelige finnelengden (figur 5E). Samlet utgjør disse resultatene viser at amputasjon tr iggers finne sammentrekning, ekstrudering av celler fra såret, og en tidsmessig forsinket regenerativ respons. Mens ekstruderte celler er sannsynlig dømt til å gjennomgå celledød, må innholdet i disse cellene til å bli ytterligere avklart. Figur 1. Imaging kammer ring montering (A) vist en plastring som er festet til et dekkglass med silikonfett. En plastduker er festet til innsiden av kammeret med fire små punkter av silikonfett. (B) Et kammer inneholdende det montert larven er fylt med Tricaine løsning og en glassplate er festet til toppen. (C) En montert to dager gammel larve (pil) er vist ved høyere forstørrelse for å fremstille dens størrelse i forhold til nettingen."_blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 2. Imaging kammer montering laget av petriskåler. (A) Vist er en kommersiell glass topp glassbunn petriskål med en plast netting festet til glass dekkglass. (B) Det er vist en selv konstruert petriskål kammer med et boret hull i lokket, og et dekkglass festet fra utsiden med silikonfett. Mesh og larven er montert inne i kammeret inneholder Tricaine løsning. Å forsegle kammeret, er silikonfett brukes på øvre, ytre kanten av bunnen kammer og topplokket vedlagt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. <img alt = "Figur 3" src = "/ files / ftp_upload / 52654 / 52654fig3.jpg" /> Figur 3. Scheme av amputasjon og montering av en larve for bildebehandling. (A) For amputasjon, plassere en bedøvet larve på en agarose-belagt petriskål og amputere halefinnen med en sprøyte nål. (B) For montering, overføre larven med en overføring pipette i en 1,5 ml rør fylt med 42 ° C væske agarose og pipette en dråpe som inneholder larven inn bildekammeret, orientere fisk og dekke størknet agarose med embryo medium. (C) Skrap av agarosen fra halefinnen ved hjelp av en avkortet microloader pipette eller lignende verktøy og erstatte embryo medium med frisk medium. (D) Bilde halefinnen under en stereomikroskop. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. <p class="jove_content" fo:keep-together.wtven på-side = "always"> Figur 4. Self-bygget oppvarmet inkubasjon kammeret. (AC) Vist er et oppvarmet inkubasjon kammer laget av papp, bobleplast og borrelås. Et kablet kuppel varmeapparat (opprinnelig utviklet for kylling egg inkubasjon) er festet til kammeret ved hjelp av aluminiumstape. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 5. Fin regenerering dynamikk. (A) Reaksjonsskjema for den benyttede halefinnen amputasjon analyse og kvantifisering metode for å bestemme den finnelengden (rød pil) og området (rød kontur av finnen). (B) halefinnen amputasjon utgangspunktet utløser sammentrekning av finnen, etterfulgt av Regenerative vev utvekst. Finnen gjennomgår også utviklings vekst, noe som gjenspeiles av den laterale størrelse økning. (C) Det er vist at finnelengden som en funksjon av tid, og viser en lineær regenerativ veksten starter på ~ 14 HPA. (D) Kvantifisering av finnen området avslører en innledningsvis avta i størrelse, noe som kan tilbakeføres til den sammentrekning av finnen. Etter ~ 14 timer, finn størrelsen øker på en lineær hastighet. (E) Sammenligning av fin lengde før amputasjon og etter 36 timers viser ~ 60% gjenvekst. Skala bar: 100 mikrometer Forkortelser: pre-amp, pre-amputasjon; timer etter amputasjon, hpa; regen, gjenfødelse; amp, amputasjon Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Film . Fin regenerering over tid løpet av 36h. Det er vist en halefinne av en 2,5-dag gamle larver i løpet av regenereringen. Starter 30 min etter amputasjon regenerativ vekst avbildes i 30 min intervaller på en stereo å bruke en 3,5x objektiv.

Discussion

Den presenterte metoden gjør for å observere sårheling og regenerering av vev i levende sebrafisk larver med in vivo time-lapse bildebehandling på en lysfelt stereomikroskop, ved hjelp av et relativt enkelt oppsett. Denne fremgangsmåten krever visse viktige aspekter som vi har testet, noe som vil optimalisere resultatet: 1) Lave agarose konsentrasjoner (~ 0,5%) vil redusere vekst hindringer av stadig voksende larvesebrafisk, 2) Fjerning av agarose rundt finnen er viktig ikke å skjule helbredelsesprosessen, 3) Overlapping agarose i en plast mesh beholder agarose og dyr i en stabil posisjon under hele prosedyren, og 4) passende temperatur-kontrollert miljø, noe som er viktig for larve levedyktighet. Vi har tilpasset en oppvarmet inkubasjon kammer ^23,24, som benytter bobleplast som er tapet på papp, og et kablet kuppel varmeapparat å kontrollere temperaturen og luftsirkulasjon med minimale svingninger i løpet avbildebehandling prosedyre. Denne enkle og kostnadseffektive kammer kan være forberedt på å passe enhver mikroskop. En tilsvarende oppvarmet inkubasjon kammeret er også benyttet for avbildnings mus og kylling utvikling ^24,29.

Vi foreslår at pre-amputert larver er montert for en pre-amputasjon image, demonteres for amputasjon, og spent for time-lapse bildebehandling. Selv om det er mulig å utføre fremgangsmåten i et enkelt trinn i den endelige avbildning kammeret, etter vår erfaring har vi funnet at amputating halefinnen på et dekkglass er ikke optimal, da den river vevet og ikke resulterer i et rent snitt. Agarosen baserte amputasjon metode ved hjelp av en sprøyte nål ble opprinnelig beskrevet av Kawakami og kolleger (2004) ¹⁶ og er også, i vår erfaring, ideelt å utføre amputasjoner. Dermed er det ganske komplisert serie av trinn som vi presenterte godt begrunnet og sikrer en optimal regenerering utfall.

Vi viste at Larval sebrafisk ved 2 dpf kan avbildes opp til 1,5 dager i agarose og Tricaine løsning. Vi brukte pH-optimalisert Tricaine (pH 7) løsning forberedt med Instant Ocean salt, som ikke forstyrrer prøven helse for den present bildebehandling periode. Vi tidligere imidlertid også vist at bruk Tricaine i Danieau medium tillater time-lapse avbildning av 2,5 dpf larvesebrafisk på en konfokal mikroskop for minst 2 dager ^30. Således kan optimal bufferbetingelser strekker larve helse og lengden av bildebehandling. Alternativt kan nedre Tricaine konsentrasjoner anvendes for anestesi, eller 2-fenoksyetanol, som vi har funnet er godt tolerert under larve og adulte stadier ved 28 ° C i minst 60 timer.

For å unngå feil i fin gjenfødelse, fjernet vi agarosen fra halefinnen før bildebehandling. Våre data viser at i løpet av 1,5 dager finnen har regenereres til omtrent 60%. Denne regenerering frekvens stemmer overens med en tidligere undersøkelse som avgrenser tre dagerer en gjennomsnittlig tid for halefinnen regenerering i sebrafisk larver opp til seks dpf ^16. Alternative metoder til agarose kunne imidlertid bli anvendt for å montere fisk for avbildning. For eksempel propper tynn plasma ³¹ eller fluorert etylen-propylen (FEP) rør som er belagt med metylcellulose og fylt med svært lave konsentrasjoner av agarose (0,1%) har vært anbefalt for lys mikros ark ^32, og kan være egnet for vår fremgangsmåte presentert. Imidlertid, har vi ikke anbefalt metylcellulose og 0,1% agarose, da de krever at prøven er montert i bunnen av kammeret på grunn av mangel på størkning av disse medier. Svært høye konsentrasjoner av metylcellulose vil dessuten generere luftlommer basert på vår erfaring, og disse kan påvirke bilde prosedyren. Hvis disse media er foretrukket til bruk i bunnkammeret, er det viktig at en passende arbeidsavstand mellom objektivlinsen og prøven er til stede. Det skal bemerkes at methylcellulose som en monteringsmedium anbefales kun for opp til 1 dag, da det kan forstyrre med larve helse ^32.

Montering av prøven i lokket kan resultere i en langsom nedadrettet gravitasjonsdrift. Det anbefales derfor å avbilde flere seksjoner på hvert tidspunkt, som enten kan projiseres inn i en enkelt plan eller kun bilder som er i fokusplanet kan trekkes ut for å sette sammen den endelige filmen. Avbildning av prøven i bunnen kammeret kan være en alternativ metode for å unngå potensiell nedadglidning. Plasmalevringer kan være nyttig for å unngå drift, som plasma vil holde seg til det ytre omsluttende lag (EVL, periderm) ³¹ og derfor kan stabilisere prøven. Dette trenger imidlertid å bli testet, samt hvor lang larve sebrafisk kan opprettholdes i plasmalevringer uten å forstyrre larve helse eller fin regenerering.

Vår film ble satt sammen utnytte enkelte seksjoner (26 mikrometer)av et innspilt z-stabel, som dekket hele tykkelsen av finnen (~ 10 nm) og som utgjorde potensiell Z-drift av finnen i avbildningsprosedyren. For å beholde 3-D-informasjon, er det også mulig å projisere z-stabler i enkeltbilder. Fordi dette kan føre til uskarphet i bildet, kan lysfelt dekonvolvering være ønsket. Programvare, for eksempel dekonvolvere eller Autoquant X3 kan utnyttes for dette formål. Alternativt kan matematiske algoritmer (beskrevet i Tadrous ³³⁾ anvendes for oppnåelse av en punkt-spredning funksjon av høyt signal-til-støy-forholdet (SNR). Innhenting av en høy SNR representerer en av de store hindrene i lysfelt dekonvolvering. Selv om denne fremgangsmåten krever høy kontrast og tynne prøvetykkelse, vil det være hensiktsmessig for avbildning av halefinnen på grunn av redusert bredde.

En klar fordel med den fremlagte avbildningsmetoden er at det er raskt tilpasses til en hvilken som helst stereomikroskop utstyrt med et CCD-kamerad time-lapse programvare og tilbyr et rimelig alternativ til dyrere confocal imaging-systemer. Selv om denne metoden ikke utnytter fluorescens for celledeteksjon, kan den forlenges for slike anvendelser ved å benytte et automatisert system for lukkerkontroll og post-avbildning dekonvolvering programvare ^34. Dette ville gjøre det mulig for brukere å ytterligere observere såret reparasjon og regenereringsprosesser med enkelt celle eller subcellulære oppløsning over lengre tidsperioder.

Den optiske klarhet og letthet som embryonale og larvesebrafisk kan håndteres, og tilpasning av denne metoden til noen stereo gjør den egnet for undervisning grunnleggende virveldyr biologi i et klasserom. Denne metoden kan gi studentene en bedre forståelse av de grunnleggende biologiske prosesser underliggende vev reparasjon og regenerering. Andre biologiske prosesser som har blitt fanget med en lignende metode er sebrafisk embryoutvikling ^23,34 og hjertefunksjon (upublisert). Denne fremgangsmåte gir også mulighet for å overvåke såret reparasjon og regenerering i larver som er blitt genetisk manipulert og farmakologisk.

Materials

Reagents
Bullseye Agarose (MidSci, Cat. No. BE-GCA500)
Low-melt agarose (Fisher BioReagents, Cat No. BP1360-100)
1-phenyl-2-thiourea [Alfa Aesar, Cat No. L06690]
Instant Ocean Aquarium Salt (Pet store)
Methylene Blue (0.1% solution) (Sigma, Cat. No. M9140)
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Sigma-Aldrich, Cat. No. E10505)
2-Phenoxyethanol (Sigma-Aldrich, Cat. No. 77699)
Petri Dish 35 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351008)
Petri Dish 60 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351007)
Petri Dish 100 x 25 mm (BD Falcon, Cat. No 351013)
5.75 inch boroschillate glass pipets (Fisher)
35 mm Glass Top Glass Bottom Dish (MatTek Corporation, Cat No. D35-20-0-TOP) Glass: 0.085-0.115mm
Superfrost/Plus microscope slides (Fisherbrand, Cat No. 12-550-15)
Glass coverslips (Electron Microscopy Services, Cat No. 72191-75)
Glass coverslips (Warner Instruments, Cat. No. CS-18R15)
Phifer Phiferglass Insect Screen Charcoal – 48" (Home Depot)
DOW CORNING® HIGH VACUUM GREASE
Microloader pipette tips 20 µl (Eppendorf, Cat. No. 930001007)
Fine Scissors – Sharply Angled Up (Fine Science Tools, Cat. No. 14037-10)
3 mL Luer-Lok™ disposable syringe (BD, Cat. No. 309657)
60 mL Luer-Lok™ disposable syringe (BD, Cat. No. 309653)
23-gauge syringe needles (BD, Cat. No. 305145)
Dumont #5 Forceps (Fine Science Tools, Cat. No. 11295-00)
Equipment
LabDoctor Mini Dry Bath (MidSci)
Zeiss Discovery.V12 compound microscope
Zeiss Plan Apo S 3.5X objective
Zeiss AxioCam MRm
Zeiss Axiovision software, Release 4.8.2SP1 (12-2011)