Adenovirus सीरोटाइप 5-vectored वैक्सीन दृष्टिकोण के विकास के लिए एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति का उपयोग
Summary
यहाँ, हम एक सबूत के सिद्धांत द्विसंयोजक एडिनोवायरस प्रकार 5 (AD5) वेक्टर उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति का उपयोग करके। इस सदिश गुणात्मक फिटनेस प्रदर्शन करने के लिए प्रदर्शन किया गया, क्षमता शामिल किया एंटीजन को AD5 पॉजिटिव इन विट्रो में सीरा, और प्रतिजनकता के साथ-साथ प्रतिरक्षाजनकता से बचने के लिए।
Abstract
Adenovirus सीरोटाइप 5 (AD5) बड़े पैमाने पर वैक्सीन के विकास के लिए पारंपरिक transgene के तरीकों के साथ संशोधित किया गया है। क्लिनिकल परीक्षण में इन पारंपरिक रूप से संशोधित AD5 वैक्टर कम efficacies मुख्य रूप से जनसंख्या के बहुमत के बीच AD5 पूर्व मौजूदा उन्मुक्ति (पी) के साथ जोड़ा जा सकता है। AD5 पी की चिंता को हल करके AD5-vectored टीका विकास को बढ़ावा देने के लिए, अभिनव एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति नियोजित किया गया है। इस रणनीति की योग्यता के आधार पर, हम पहले hexon शटल निर्माण AD5-vectored प्लाज्मिड HVR1-KWAS-HVR5-उनका एक पहले का निर्माण शटल प्लाज्मिड HVR5-अपने 6 / pH5S में hypervariable क्षेत्र (HVR) hexon के 1 subcloning द्वारा 6 / pH5S, उसकी 6 टैग HVR5 में शामिल किया था जो। एक एचआईवी मिलान ELDKWAS युक्त इस HVR1 डीएनए टुकड़ा संश्लेषित किया गया था। HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 / pH5S, तो linearized और linearized रीढ़ प्लाज्मिड pAd5 / ΔH5 (जीएल) के साथ सह तब्दील हो गया थामुताबिक़ पुनर्संयोजन के लिए। PAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था इस recombined प्लाज्मिड वायरल वेक्टर AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 उत्पन्न करने के लिए। इस सदिश वायरल शारीरिक अनुमापांक (उपाध्यक्ष / एमएल) ने संकेत दिया गुणात्मक स्वास्थ्य, संक्रामक अनुमापांक (आईपी / एमएल) और इसी वी.पी. / आईपी अनुपात को मान्य किया गया था। दोनों एचआईवी मिलान और उसकी 6 टैग सतह उजागर AD5 कैप्सिड पर थे, और अपने स्वयं के मिलान विशिष्ट प्रतिजनकता बनाए रखा। एक निराकरण परख इन विट्रो में AD5 पॉजिटिव सीरा द्वारा निराकरण नाकाम करने के लिए इस द्विसंयोजक वेक्टर की क्षमता का संकेत दिया। चूहे प्रतिरक्षण एचआईवी मिलान और 6 उसके लिए मजबूत humoral रोगक्षमता विशिष्ट की पीढ़ी का प्रदर्शन किया। इस सबूत के सिद्धांत अध्ययन एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति के साथ जुड़े प्रोटोकॉल feasibly अलग कैप्सिड प्रोटीन को संशोधित करके AD5-vectored टीकों के उत्पादन के लिए उपयोग किया जा सकता है कि सुझाव दिया। इस प्रोटोकॉल भी च जा सकता हैurther दुर्लभ सीरोटाइप एडिनोवायरस-vectored टीके की पीढ़ी के लिए संशोधित।
Introduction
मानव adenovirus (एडी) एक डबल असहाय डीएनए जीनोम युक्त icosahedral nucleocapsid के साथ एक मध्यम आकार, गैर छा वायरस है। विज्ञापन सात समूहों में एक वर्गीकरण (जी के माध्यम से एक) के साथ, Adenoviridae परिवार के अंतर्गत आता है। प्रत्येक समूह के विभिन्न सीरमप्रकारों के वायरस होते हैं। ग्रुप सी से adenovirus है, जो सीरोटाइप 5 (AD5) के सबसे बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है और सबसे व्यापक रूप से जीन थेरेपी और टीकाकरण जैसे vectored दृष्टिकोण के लिए आवेदन किया।
पारंपरिक transgene रणनीति विकसित की है और एक जीन के हित के साथ वायरस जल्दी जीनों के विस्थापन के द्वारा होती है जो AD5 संशोधनों के लिए आवेदन किया है, और जीन के हित एक मेजबान में केंद्रित अभिव्यक्ति की गई है। उदाहरण बंदर का इम्यूनो वायरस 1 की फिरना जीन के साथ जल्दी जीन 3 (E3) की जगह से pENV9 / Ad5hrΔE3 का निर्माण कर रहे हैं, ह्यूमन इम्यूनो का ढकोसला जीन के साथ जल्दी जीन 1 (ई 1) की जगह से AdCMVGag का निर्माणवायरस (एचआईवी) 2, और लैक जेड गुणसूत्र 3 के साथ ई 1 की जगह से विज्ञापन लैक जेड का निर्माण। AD5 पर पारंपरिक transgene रणनीति की व्यापक आवेदन निम्नलिखित योग्यता के आधार पर निर्भर करता है: AD5, वायरस और वायरस प्रचार पर संभव जीन इंजीनियरिंग, विदेशी जीन डालने की बड़ी आवास और AD5 4,5 की सुरक्षा के लिए मेजबान टीम की व्यापक रेंज। हालांकि, इस रणनीति के प्रयोग के द्वारा AD5-vectored नैदानिक चिकित्सा के कम efficacies AD5 बच्चों और वयस्कों के 4,6 के बहुमत के बीच बहुत प्रचलित है, के बाद से मुख्य रूप से AD5 पी के साथ जुड़े होने के लिए मैप किया गया है, जो एक बड़ी अड़चन, कर दिया गया है।
AD5 की बड़ी अड़चन को दूर करने, प्राथमिक उद्देश्य AD5 पी circumventing एक वैकल्पिक रणनीति विकसित करने के लिए है। इस तरह निष्क्रिय करने एंटीबॉडी (nabs) 8-10 और CD8 + टी सेल प्रतिक्रिया के रूप में अंतर्जात प्रतिरक्षा 7, अनुकूली उन्मुक्ति AD5 के खिलाफ 10 सह करने के लिए दिखाया गया हैAD5 nabs AD5 पी 10,11 के योगदान में प्रमुख भूमिका निभाने के लिए प्रदर्शित होने के साथ, AD5 पी को ntribute। इसके अलावा, AD5 प्रमुख प्रोटीन hexon, फाइबर और Penton बेस सहित कैप्सिड प्रोटीन में स्थित लक्ष्य epitopes, nabs। जिसमें से hexon AD5 nabs 8,11-13 का प्रमुख लक्ष्य है। इन निष्कर्षों के आधार पर, एक अभिनव एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति शुरू की गई है। इस उपन्यास रणनीति nabs और कुशल AD5 वेक्टर प्रशासन की कमी हुई मान्यता के लिए अग्रणी, प्रोटीन के हित AD5 को निष्क्रिय epitopes बदलाव या मास्क जो AD5 कैप्सिड प्रोटीन, पर के प्रतिस्थापन या समावेश पर प्रकाश डाला गया। यह भी मेजबान टीम सीधे प्रतिरक्षा प्रणाली को 4,14,15 को एंटीजन के हित पेश करके मजबूत humoral प्रतिरक्षा और शक्तिशाली सेलुलर उन्मुक्ति बटोर कर सकते हैं क्योंकि इस रणनीति प्रतिस्पर्धी है कि उल्लेखनीय है। इस रणनीति के आधार पर, आणविक क्लोनिंग और पुनः संयोजक विज्ञापन वायरल वेक्टर बचाव संरचनात्मक रूप से विभाजित किया जा सकता हैचार मुख्य चरण में: (क) या तो पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) या संश्लेषण से जीन के हित टुकड़ा तैयार करना; (ख) एक एडिनोवायरस रीढ़ की हड्डी से जीन के हित टुकड़ा और मुताबिक़ बाहों में शामिल है कि एक शटल प्लाज्मिड में जीन टुकड़ा बंधाव; (ग) द्वारा मुताबिक़ पुनर्संयोजन सह बदलने linearized रीढ़ प्लाज्मिड pAd5 / ΔH5 (जीएल) के साथ 16 जीन के हित टुकड़ा युक्त शटल प्लाज्मिड; (घ) linearized पुनः संयोजक adenoviral प्लाज्मिड के अभिकर्मक एंटीजन के हित के साथ शामिल पुनः संयोजक विज्ञापन वेक्टर बचाव करने के लिए।
हमारे समूह और कुछ अन्य विभिन्न संक्रामक रोगजनकों के खिलाफ विज्ञापन vectored वैक्सीन के विकास के लिए इस विकल्प के विज्ञापन समावेश रणनीति बढ़ा दिया है। हम एक पुनः संयोजक विज्ञापन वेक्टर की पीढ़ी की सूचना दी विज्ञापन HVR1-एलजीएस-उनकी AD5 hexon (hexon5) की HVR1 स्थान में एक उनकी टैग एचआईवी -1 प्रतिजन वी 3 शामिल द्वारा 6 -V3। यह उत्पन्न वेक्टर एसटीआर ट्रिगरवी 3 मिलान करने के लिए 4 विशिष्ट ओंग प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया। हम यह भी hexon5 2 की HVR2 वातावरण में एचआईवी -1 झिल्ली समीपस्थ ectodomain क्षेत्र (MPER) को शामिल करके AD5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 के विकास की सूचना दी। इसके अलावा, डॉ झोउ समूह विज्ञापन सीरोटाइप 3 (AD3) vectored टीके, अर्थात। विकसित करने के लिए इस विज्ञापन समावेश रणनीति के लाभ के लिए इस्तेमाल किया गया है, AD3 की HVR1 में Enterovirus 71 के एक निष्क्रिय मिलान SP70 शामिल द्वारा वायरल वेक्टर R1SP70A3 की पीढ़ी hexon (hexon3)। R1SP70A3 Enterovirus 71 चुनौती 15 के खिलाफ संरक्षण की उच्च दर के लिए नेतृत्व जो मिलान SP70 के लिए विशिष्ट मजबूत nabs और IFN-γ उत्पादन, उत्पन्न।
तकनीकी संदर्भ के प्रयोजन के लिए, हमारे अध्ययन HVR1 में एक एचआईवी -1 प्रतिजन को शामिल करके एक द्विसंयोजक AD5 वेक्टर AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 की पीढ़ी पर ध्यान केंद्रित करने के लिए गुणात्मक एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति का फायदा उठाया एकदा hexon5 की HVR5 में उनकी टैग। उत्पन्न वायरल वेक्टर भी immunologically मूल्यांकन किया गया था। एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति विभिन्न संक्रामक रोगों के खिलाफ AD5-vectored टीकाकरण दृष्टिकोण के विकास की दिशा में उपयोग किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
टीके के विकास के लिए AD5 संशोधन पर पारंपरिक transgene रणनीति के आवेदन के कारण मुख्य रूप से AD5 पी 4,6 के साथ जुड़े टोंटी को कम किया गया है। इस टोंटी आंशिक रूप से इस रणनीति AD5 nabs द्वारा निराकरण बचने कर सकते हैं के बा?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
स्वास्थ्य 5T32AI7493-20 और 5R01AI089337-03 अनुदान का यह काम राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था। funders के अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी।
Materials
| 1x DPBS | Thermo Scientific | SH30256.01 | for cell spliting |
| 10x DPBS | Thermo Scientific | SH30378.02 | for dialysis buffer preparation |
| glycerol | SIGMA | G5516-1L | for dialysis buffer preparation |
| SDS | BIO-RAD | 161-0301 | for virus lysis buffer preparation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30910.03 | component of culture medium |
| 100X Non-Essential Amino Acids | Thermo Scientific | SH30238.01 | component of culture medium |
| 200mM/L L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | component of culture medium |
| penicillin/streptomycin solution | Cellgro | 30-002-CI | component of culture medium |
| DMEM with high glucose | Thermo Scientific | SH30081.01 | for HEK293 cell culture |
| Minimum Essential Medium Eagle | SIGMA | M5650 | for HeLa cell culture |
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol | SIGMA | P3803-100ML | for large size of DNA purification |
| cesium chloride | Research Products International Corp. | C68050 | for virus purificiation |
| HEPES | Cellgro | 25-060-CI | for CsCl solution preparation |
| HEK293 | ATCC | 51-0036 | for virus rescue and upscale |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | for neutralization assay |
| T-25 flask | Thermo Scientific | 156367 | for cell culture |
| T-75 flask | CORNING | 430641 | for cell culture |
| T-175 flask | Thermo Scientific | 159910 | for cell culture |
| Ultracentrifuge | BECKMAN | NA | for virus purification |
| Ultracentrifuge tube | BECKMAN | 344059 | for virus purification |
| dialysis cassette | Thermo Scientific | 66380 | for virus dialysis |
| ELISA plate | Thermo Scientific | 442404 | for ELISA |
| human anti-gp41 (2F5) mAb | NIH AIDS Reagent Program | 1475 | for immunological assays |
| mouse anti-His tag mAb | GenScript | A00186 | for immunological assays |
| SOC medium | CORNING | 46-003-CR | for transformation |
| PCR master mix solution | QIAGEN | 201445 | for PCR |
| Animal lancet (point length at 5mm) | MEDIpoint | for mice bleeding | |
| Biophotometer | Eppendorf | for virus physical titer titration |
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