Använda Antigen Capsid-inkorporering strategi för utveckling av adenovirus serotyp 5-vektor Vaccine Approaches
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att generera ett proof-of-principle tvåvärd adenovirus typ 5 (Ad5) vektor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 genom att använda antigenet Capsid-Incorporation strategi. Denna vektor visat sig uppvisa kvalitativ kondition, till förmågan fly Ad5-positiva sera in vitro och antigeniciteten samt immunogenicitet till de införlivade antigenerna.
Abstract
Adenovirusserotyp 5 (Ad5) har i stor utsträckning modifierats med traditionella transgena metoder för vaccinutveckling. De reducerade verkningsgrad av dessa traditionellt modifierade Ad5 vektorer i kliniska prövningar kan i första hand korrelerad med Ad5 existerande immunitet (PEI) bland majoriteten av befolkningen. Att främja Ad5-vektorvaccinutveckling genom att lösa den oro som Ad5 PEI, har innovativa Antigen Capsid-Incorporation strategi använts. Genom förtjänsten av denna strategi, Ad5-vektoriserade vi först byggde hexon skyttelplasmid HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S genom subkloning den hypervariabla regionen (HVR) 1 av hexon i en tidigare konstruerad skyttelplasmid HVR5-His 6 / pH5S, som hade Hans 6 tag införlivas HVR5. Detta HVR1 DNA-fragment innehållande en HIV-epitop ELDKWAS syntetiserades. HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S var då arise och samtransformeras med linjäriserad ryggrad plasmid pAd5 / ΔH5 (GL),för homolog rekombination. Detta rekombinerade plasmid pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 transfekterades in i celler för att generera virusvektor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. Denna vektor valideras för att ha kvalitativa kondition indikeras av viral fysiska titer (VP / ml), infektiös titer (IP / ml) och motsvarande VP / IP-förhållande. Både HIV-epitopen och hans 6 tag var ytexponerade på Ad5 kapsiden, och behöll epitopspecifik antigenicitet av sina egna. En neutralisering analys visade förmågan hos denna divalenta vektor för att kringgå neutralisering med Ad5-positiva sera in vitro. Möss immunisering visat generation av robusta humoral immunitet specifik för HIV-epitopen och hans 6. Detta proof-of-principle studie antydde att protokollet i samband med antigenet Capsid-Inkorporering strategi kan rimligen utnyttjas för generering av Ad5-vektoriserade vacciner genom att modifiera olika kapsidproteiner. Detta protokoll kan även fTTERLIGARE modifierad för generering av sällsynta serotyp adenovirus-vektorvacciner.
Introduction
Humant adenovirus (Ad) är ett medelstort, utan hölje virus med en ikosaedriska nukleokapsid som innehåller en dubbelsträngad DNA-genomet. Ad tillhör Adenoviridae familjen, med en indelning i sju grupper (A till G). Varje grupp innehåller virus av olika serotyper. Varav adenovirusserotyp 5 (Ad5) från grupp C har varit den mest omfattande studier och tillämpas mest för vektoriserade metoder som genterapi och vaccinationer.
Den traditionella transgen strategi har utvecklats och tillämpats för Ad5 ändringar, som kännetecknas av förskjutningen av virus tidiga gener med en gen av intresse, och den fokuserade uttryck av genen av intresse i en värd. Exempel är konstruktionen av pENV9 / Ad5hrΔE3 genom att ersätta tidig gen 3 (E3) med rev-genen av simian immunbristvirus 1, byggandet av AdCMVGag genom att ersätta tidig gen 1 (E1) med gag-genen av humant immunbristVirus (HIV) 2, och byggandet av Ad lac Z genom att ersätta E1 med lac Z-genen 3. Den breda tillämpningen av den traditionella transgen strategi för Ad5 beror på följande meriter: de många datorer i Ad5, genomförbara genteknik på virus och virusförökning, den stora boende av främmande gen insatsen och säkerhet Ad5 4,5. Däremot har de reducerade effektivitet av Ad5-vektoriserade kliniska terapier genom användning av denna strategi varit en stor flaskhals, som har kartlagts till i första hand förknippas med Ad5 PEI, eftersom Ad5 är så utbredd bland de flesta barn och vuxna 4,6.
För att övervinna det stora hinder som Ad5, är det primära målet att utveckla en alternativ strategi kringgå Ad5 PEI. Medfödd immunitet 7, adaptiv immunitet såsom neutraliserande antikroppar (NABS) 8-10 och CD8 + T-cellsvar 10 mot Ad5 har visats contribute Ad5 PEI, med Ad5 haffar ser ut att spela en dominerande roll i bidragen till Ad5 PEI 10,11. Dessutom Ad5 haffar målepitoper ligger i kapsidproteiner, inklusive den stora protein hexon, fiber och penton bas. Varav är hexon huvudmålet för Ad5 haffar 8,11-13. Baserat på dessa upptäckter har en innovativ antigen Capsid-Incorporation strategi införts. Denna nya strategi belyser utbyte eller inkorporering av proteiner-of-intresse på Ad5 kapsidproteiner, som skiftar eller döljer Ad5 neutraliserande epitoper, vilket leder till minskade erkännande av alkoholfria drycker och effektiva Ad5 vektor förvaltningar. Det är anmärkningsvärt att denna strategi är konkurrenskraftiga eftersom det kan också hjälpa värdar framkallar robust humoral immunitet och potent cellulär immunitet genom att direkt presentera antigener av intresse för immunsystemet 4,14,15. Baserat på denna strategi, kan den molekylära kloningen och rekombinant Ad virusvektor räddning strukturellt delasi fyra steg: (a) framställning av genen av intresse fragment av antingen polymerase chain reaction (PCR) eller syntes; (B) ligering av genen fragment i en skyttel plasmid som innehåller genen av intresse fragment och homologa vapen till ett adenovirus ryggrad; (C) den homolog rekombination genom samtidig omvandla buss plasmid som innehåller genen av intresse fragment med arise ryggraden plasmiden pAd5 / ΔH5 (GL) 16; (D) transfektion av arise rekombinanta adenovirala plasmid för att rädda den rekombinanta Ad vektorn införlivas med antigen-of-intresse.
Vår grupp och några andra har utökat denna alternativa annons införlivande strategi för Ad vektoriserade vaccinutveckling mot olika patogener. Vi rapporterade generering av en rekombinant Ad vektor Ad-HVR1-LGS-His 6 -V3 genom införlivande av en His-märkt HIV-1-antigenet V3 in HVR1 locale av Ad5 hexon (hexon5). Detta genererade vektor utlöste strong humoralt immunsvar specifikt mot V3-epitopen 4. Vi rapporterade också utvecklingen av Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 genom införlivande HIV-1-membran proximala ektodomän region (MPER) i HVR2 locale av hexon5 2. Dessutom har Dr Zhou grupp använt fördelarna med denna annons införlivande strategi att utveckla annons serotyp 3 (Ad3) vektoriserade vacciner, dvs., Generering av virusvektor R1SP70A3 genom att införliva en neutraliserande epitop SP70 av Enterovirus 71 i HVR1 av Ad3 hexon (hexon3). R1SP70A3 genererade starka alkoholfria drycker och IFN-γ produktion specifika för epitopen SP70, som leder till den höga graden av skydd mot Enterovirus 71 utmaning 15.
För tekniska referens, tog vår studie fördel av den kvalitativa Antigen Capsid-inkorporering strategi att fokusera på produktion av en tvåvärd Ad5 vektor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 genom att införliva en HIV-1-antigen i HVR1 enda His-markör in HVR5 av hexon5. Den alstrade virala vektorn var också immunologiskt utvärderades. Den Antigen Capsid-Inkorporering strategi skulle kunna användas för att utveckla Ad5-vektoriserade vaccinations metoder mot olika infektionssjukdomar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tillämpningen av den traditionella transgen strategi för Ad5 ändring för utveckling av vaccin har minskat främst på grund av flaskhalsen i samband med Ad5 PEI 4,6. Denna flaskhals kan delvis minskas genom tillämpning av alternativa Antigen Capsid-Incorporation strategi (Figur 1A), eftersom denna strategi kan undgå neutralisering av Ad5 alkoholfria drycker genom att ersätta neutraliserande epitoper av Ad5 med antigener-of-intresse, och underlätta bildandet av robust immunitet till de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av National Institutes of Health ger 5T32AI7493-20 och 5R01AI089337-03. De finansiärer hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet.
Materials
| 1x DPBS | Thermo Scientific | SH30256.01 | for cell spliting |
| 10x DPBS | Thermo Scientific | SH30378.02 | for dialysis buffer preparation |
| glycerol | SIGMA | G5516-1L | for dialysis buffer preparation |
| SDS | BIO-RAD | 161-0301 | for virus lysis buffer preparation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30910.03 | component of culture medium |
| 100X Non-Essential Amino Acids | Thermo Scientific | SH30238.01 | component of culture medium |
| 200mM/L L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | component of culture medium |
| penicillin/streptomycin solution | Cellgro | 30-002-CI | component of culture medium |
| DMEM with high glucose | Thermo Scientific | SH30081.01 | for HEK293 cell culture |
| Minimum Essential Medium Eagle | SIGMA | M5650 | for HeLa cell culture |
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol | SIGMA | P3803-100ML | for large size of DNA purification |
| cesium chloride | Research Products International Corp. | C68050 | for virus purificiation |
| HEPES | Cellgro | 25-060-CI | for CsCl solution preparation |
| HEK293 | ATCC | 51-0036 | for virus rescue and upscale |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | for neutralization assay |
| T-25 flask | Thermo Scientific | 156367 | for cell culture |
| T-75 flask | CORNING | 430641 | for cell culture |
| T-175 flask | Thermo Scientific | 159910 | for cell culture |
| Ultracentrifuge | BECKMAN | NA | for virus purification |
| Ultracentrifuge tube | BECKMAN | 344059 | for virus purification |
| dialysis cassette | Thermo Scientific | 66380 | for virus dialysis |
| ELISA plate | Thermo Scientific | 442404 | for ELISA |
| human anti-gp41 (2F5) mAb | NIH AIDS Reagent Program | 1475 | for immunological assays |
| mouse anti-His tag mAb | GenScript | A00186 | for immunological assays |
| SOC medium | CORNING | 46-003-CR | for transformation |
| PCR master mix solution | QIAGEN | 201445 | for PCR |
| Animal lancet (point length at 5mm) | MEDIpoint | for mice bleeding | |
| Biophotometer | Eppendorf | for virus physical titer titration |
References
- Cheng, S. M., et al. Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant. Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).
- Matthews, Q. L., et al. HIV antigen incorporation within adenovirus hexon hypervariable 2 for a novel HIV vaccine approach. PloS one. 5, e11815 (2010).
- DeMatteo, R. P., et al. Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression. Journal of virology. 71, 5330-5335 (1997).
- Gu, L., et al. A recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the V3 loop of HIV-1 gp120 in mice through the ‘Antigen Capsid-Incorporation’ strategy. Virology journal. 11, 112 (2014).
- Matthews, Q. L., Krendelchtchikov, A. L. G., Li, Z. C. Viral Vectors for Vaccine Development. INTECH. , (2013).
- Tang, D. C., Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., Van Kampen, K. R. Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines. Expert review of vaccines. 8, 469-481 (2009).
- Flatt, J. W., Kim, R., Smith, J. G., Nemerow, G. R., Stewart, P. L. An intrinsically disordered region of the adenovirus capsid is implicated in neutralization by human alpha defensin 5. PloS one. 8, e61571 (2013).
- Bradley, R. R., Lynch, D. M., Iampietro, M. J., Borducchi, E. N., Barouch, D. H. Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection. Journal of virology. 86, 625-629 (2012).
- Zaiss, A. K., Machado, H. B., Herschman, H. R. The influence of innate and pre-existing immunity on adenovirus therapy. Journal of cellular biochemistry. 108, 778-790 (2009).
- Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors. Journal of virology. 78, 2666-2673 (2004).
- Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein. Journal of immunology. 174, 7179-7185 (2005).
- Bradley, R. R., et al. Adenovirus serotype 5-specific neutralizing antibodies target multiple hexon hypervariable regions. Journal of virology. 86, 1267-1272 (2012).
- Gahery-Segard, H., et al. Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity. Journal of virology. 72, 2388-2397 (1998).
- Gu, L., et al. Using multivalent adenoviral vectors for HIV vaccination. PloS one. 8, e60347 (2013).
- Tian, X., et al. Protection against enterovirus 71 with neutralizing epitope incorporation within adenovirus type 3 hexon. PloS one. 7, e41381 (2012).
- Wu, H., et al. Construction and characterization of adenovirus serotype 5 packaged by serotype 3 hexon. Journal of virology. 76, 12775-12782 (2002).
- Wu, H., et al. Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation. Journal of virology. 79, 3382-3390 (2005).
- Qiu, H., et al. Serotype-specific neutralizing antibody epitopes of human adenovirus type 3 (HAdV-3) and HAdV-7 reside in multiple hexon hypervariable regions. Journal of. 86, 7964-7975 (2012).
- Parker, C. E., et al. Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5. Journal of virology. 75, 10906-10911 (2001).
- Farrow, A. L., et al. Immunization with Hexon Modified Adenoviral Vectors Integrated with gp83 Epitope Provides Protection against Trypanosoma cruzi Infection. PLoS neglected tropical diseases. 8, e3089 (2014).
- Krause, A., et al. Epitopes expressed in different adenovirus capsid proteins induce different levels of epitope-specific immunity. Journal of virology. 80, 5523-5530 (2006).
- Omori, N., et al. Modification of a fiber protein in an adenovirus vector improves in vitro gene transfer efficiency to the mouse microglial cell line. Neuroscience letters. 324, 145-148 (2002).
- Dmitriev, I. P., Kashentseva, E. A., Curiel, D. T. Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX. Journal of virology. 76, 6893-6899 (2002).
- Xue, C., et al. Construction and characterization of a recombinant human adenovirus type 3 vector containing two foreign neutralizing epitopes in hexon. Virus research. 183, 67-74 (2014).
- Tian, X., et al. Construction and characterization of human adenovirus serotype 3 packaged by serotype 7 hexon. Virus research. 160, 214-220 (2011).
- Kim, J. W., et al. An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer. PloS one. 8, e55533 (2013).
- Vasconcelos, J. R., et al. Pathogen-induced proapoptotic phenotype and high CD95 (Fas) expression accompany a suboptimal CD8+ T-cell response: reversal by adenoviral vaccine. PLoS pathogens. 8, e1002699 (2012).
- Matthews, Q. L., et al. Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion. Molecular imaging. 5, 510-519 (2006).
