Metodi per la coltura di femore umano espianti di tessuto di studio sul carcinoma della mammella cellulare colonizzazione della nicchia metastatico
Summary
I protocolli sono descritti per studiare la migrazione delle cellule del cancro al seno, la proliferazione e la colonizzazione in un tessuto osseo sistema modello espianto umana.
Abstract
Bone è la sede più comune di metastasi del cancro al seno. Anche se è ampiamente accettato che il comportamento delle cellule di cancro influenze microambiente, poco si sa circa le proprietà delle cellule del cancro al seno e comportamenti all'interno del microambiente nativo del tessuto osseo umano. Abbiamo sviluppato approcci per monitorare, quantificare e modulare le cellule del cancro al seno umano nel microambiente di frammenti umani in coltura di tessuto osseo isolati da teste femorali scartati seguenti totali interventi chirurgici di sostituzione dell'anca. Usando le cellule del cancro al seno ingegnerizzate per luciferasi e migliorate proteina fluorescente verde (EGFP) espressione, siamo in grado di quantificare in modo riproducibile di migrazione e proliferazione modelli che utilizzano l'imaging bioluminescenza (BLI), interazioni cellulari pista entro i frammenti ossei mediante microscopia a fluorescenza, e valutare le cellule del seno dopo colonizzazione con citometria a flusso. I vantaggi principali di questo modello sono: 1) un nativo, MicroE tessuto architettonico intattonvironment che include importanti tipi di cellule umane, e 2) l'accesso diretto al microambiente, che facilita la rapida quantitativa e monitoraggio qualitativo e perturbazione del seno e delle cellule delle ossa proprietà, comportamenti e interazioni. Una limitazione primaria, attualmente, è finita la vitalità dei frammenti di tessuto, che delimita la finestra di studio per coltura breve termine. Applicazioni del sistema modello comprendono lo studio della biologia di base di cancro al seno e di altri tumori maligni ossa cerca all'interno della nicchia metastatica, e lo sviluppo di strategie terapeutiche per indirizzare in modo efficace le cellule del cancro al seno nei tessuti ossei.
Introduction
Il microambiente tumorale è ampiamente riconosciuto come un fattore determinante del comportamento delle cellule di cancro durante la progressione del cancro al seno e metastasi diffuse 1-3. L'obiettivo del metodo presentato qui è quello di facilitare lo studio delle cellule del cancro al seno nel microambiente del tessuto osseo umano, la sede più frequente di cancro al seno metastasi 4-6. Bone comprende mineralizzati e midollo compartimenti 7-9, entrambe ospitano cellule e fattori secreti implicati nella progressione metastatica 10,11. Benché ampiamente utilizzato de modelli di topo vivo facilitare studi sistemici del processo metastatico 12-15, interazioni delle cellule all'interno dello scheletro non sono facilmente accessibili per l'osservazione e la perturbazione diretta. Sistemi modello per lo studio e la coltura dei tessuti osseo di topo e cellule del mouse midollo forniscono un migliore accesso e hanno prodotto molte intuizioni per quanto riguarda le interferenze ei meccanismi alla base delle cellule del cancro al seno metastasis dello scheletro murino 16-22. Tuttavia, gli studi hanno suggerito che ci possono essere specie-specifiche modelli di osteotropism per il tessuto osseo 23,24. Questi modelli potrebbero riflettere specie-specifiche intrinseche differenze nelle proprietà del tessuto osseo, differenze derivanti dalla alterati popolazioni di midollo osseo in topi con deficit immunitario 11, e / o la relativamente giovane età di topi utilizzati in esperimenti, che sono tutti probabili determinanti dell'osso microambiente.
In vitro approcci per studiare le cellule del cancro al seno in co-colture di ossa umane sono in genere concentrati su specifici tipi di cellule di osso, come osteoblasti derivate dal midollo o cellule stromali in coltura come monostrato oa ingegnerizzati sistemi modello 3-dimensionale 25-35. Sebbene i modelli di coltura cellulare a 2 dimensioni hanno costituito la colonna portante di in vitro approcci per la ricerca sul cancro, si è da tempo riconosciuto che il comportamento delle cellule è fondamentalmente alterata in monolayer sistemi di coltura 18,36,37. Questo ha portato allo sviluppo di microambienti ingegnerizzati che imitano la complessità dei tessuti viventi 3-dimensionali, compresi da matrice e modelli basati scaffold composti di materiali naturali quali collagene, polimeri sintetici o seminate con specifici tipi cellulari per creare microambienti tessuto-like 36-41. Approcci di ingegneria hanno incluso anche l'uso di piattaforme bioreattore per controllare e studiare il milieu ormonale del microambiente 18,19,41-43. Sebbene i modelli biomimetici e bioreattori forniscono molti elementi di un microambiente tissutale complesso in un ambiente controllato, e sono state applicate con successo per promuovere lo studio delle metastasi del cancro al seno alle ossa 18,19,35,42,43, sistemi modello ingegnerizzati genere non incorporano l'intera gamma di tipi di cellule e componenti della matrice extracellulare presenti all'interno dell'ambiente osso nativo.
Fino a poco tempo, il cancro al senocellule non sono stati studiati nel nativa, intatta, microambiente 3-dimensionale del tessuto osseo umano. Recentemente abbiamo segnalato lo sviluppo di un modello di co-coltura con frammenti di tessuto osseo umano isolato da protesi totale d'anca (THR) Chirurgia campioni 44. Questi esemplari porto sia i comparti mineralizzate e midollo necessarie per studiare i meccanismi alla base di micro-metastasi in coltura breve termine. In lavori precedenti abbiamo stabilito prova di principio per l'utilizzo di bioluminescenza (BLI) per monitorare la proliferazione delle cellule del cancro al seno-luciferasi che esprimono (MDA-MB-231-Fluc) co-coltura con frammenti di ossa 44. Qui vi presentiamo dettagliate protocolli sperimentali per lo studio la proliferazione delle cellule del cancro al seno, la colonizzazione, e la migrazione nel contesto del microambiente nativo utilizzando espianti di tessuto osseo umano.
Innanzitutto vi presentiamo un protocollo per la co-coltura di cellule di cancro al seno adiacenti frammenti ossei per misurare senoproliferazione cellulare utilizzando BLI. In questa sezione, sospensioni di cellule vengono seminate al seno come macchie di cellule in piastre da 6 pozzetti adiacenti frammenti ossei, che sono immobilizzati da pezzi di cera ossea. Pozzetti di controllo contengono cera ossea, ma nessun frammento osseo. Una volta che i punti di cellule attaccano, si aggiunge medio e il piatto è in coltura per 24 ore, dopo di che l'intensità del segnale bioluminescente (associato al numero di cellulare) viene misurata con BLI. Nella fase successiva vi presentiamo i metodi per le cellule del cancro al seno co-coltura seminati direttamente su frammenti di ossa di studiare la colonizzazione e la proliferazione. Qui le sospensioni cellulari seno sono pipettati direttamente sui frammenti di tessuto osseo, che sono monitorati nella cultura da BLI e microscopia a fluorescenza nel tempo per monitorare la colonizzazione e il numero di cellulare. In questo metodo, il vano osseo può essere lavato dai frammenti ossei in qualsiasi punto di tempo per l'analisi di cellule di carcinoma mammario colonizzati mediante citometria di flusso, o saggi di vitalità osseo.
Inoltre, Describa due diversi approcci per misurare la migrazione delle cellule del cancro al seno. Nel primo metodo passaggi vengono descritti per misurare la migrazione verso tessuto osseo supernatanti di coltura. In questo protocollo le cellule tumorali del seno vengono seminate sulle interni, superfici superiori di Transwell inseriscono membrane con un 8 micron dimensione dei pori (come mostrato nella Figura 1A). Gli inserti vengono poi poste in un piatto ricevitore con pozzetti contenenti surnatante tessuto osseo o mezzo di controllo. Nel corso di un periodo di incubazione di 20 ore, un piccolo numero di cellule di carcinoma mammario migrano attraverso le membrane inserto giù nei pozzetti inferiori tessuto coltura dove attaccano alla rivelazione per BLI. Nel secondo metodo di migrazione delle cellule tumorali del seno vengono seminate sulle superfici esterne inferiori delle membrane inserti Transwell. Frammenti di tessuto osseo vengono inseriti nelle tazze di inserimento e le cellule di carcinoma mammario migrano attraverso le membrane a colonizzare i frammenti ossei (come mostrato nella Figura 1B), chevengono poi ripreso con BLI.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mehra et al. Hanno descritto in precedenza la raccolta e l'analisi di campioni ossei postmortem di pazienti affetti da carcinoma prostatico metastatico raccolte al momento dell'autopsia, rivelando i tessuti di alta qualità e per validare l'uso di campioni di ossa umane per studiare il processo metastatico 47. Qui abbiamo descritto i protocolli per la raccolta, l'elaborazione e l'utilizzo di frammenti di tessuto osseo umano ottenuti da teste femorali scartati dopo l'intervento…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questi studi sono stati finanziati, in parte, da finanziamenti della ricerca e sviluppo della Fondazione alternativa (107.588), l'Istituto Nazionale della Salute (1U54CA136465-04S1), e la California Breast Cancer Research Program (201B-0141). Ringraziamo Drs. Andrew Wilber e R. Scott McIvor per la generosa donazione di loro transponson e PK / hUbiC-SB11 plasmidi trasposasi. Noi riconosciamo con gratitudine John Tamaresis, Ph.D. per consigli su metodi statistici, Timothy Brown per l'esecuzione di citometria a flusso, Georgette Henrich per consigli su migrazioni saggi, e Nancy Bellagamba per facilitare la raccolta di campioni THR.
Materials
| DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| McCoy's 5A Medium (1X) | Life Technologies | 16600-082 | Supplement all McCoy's with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillen Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Blastocidin (10 mgl/ml) | InvivoGen | ant-bl | Supplement media used for transfected cell lines. |
| Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size) | Corning Incorporated | 353097 | |
| Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate | Corning Incorporated | 353504 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells* | Invitrogen Detection Technologies | L-3224 | |
| FluoroBrite DMEM | Life Technologies | A18967-01 | |
| D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL) | Life Technologies | L-8220 | |
| Sterile Cell Strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3516 | |
| 12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3513 | |
| 24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3526 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Bone wax | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
| IVIS 50 Imaging Platform | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
| Living Image Software Program | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | 133026 | |
| EVOS FL Imaging System | Life Technologies | Version 4.2 | |
| OsteoSense 680 EX | PerkinElmer | NEV10020EX | |
| MCF-7 breast cancer cells | ATCC | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | |
| Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody | DAKO Cytomation | Clone (AE1/AE3) |
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