Une In Vitro Modèle dormance du cancer du sein sensible aux œstrogènes dans la moelle osseuse: un outil pour les études de mécanisme moléculaire et Hypothèse Generation

Summary

Nous avons développé un modèle in vitro de dormance dans la moelle osseuse pour des cellules cancéreuses du sein sensibles aux œstrogènes. L’objectif de ce protocole est de démontrer l’utilisation du modèle pour l’étude de la biologie moléculaire et cellulaire de la dormance et pour la génération d’hypothèses pour des tests ultérieurs in vivo.

Abstract

L’étude de la dormance du cancer du sein dans la moelle osseuse est une entreprise exceptionnellement difficile en raison de la complexité des interactions des cellules dormantes avec leur microenvironnement, de leur rareté et de l’excès écrasant de cellules hématopoïétiques. À cette fin, nous avons développé un modèle clonogénique 2D in vitro de la dormance de cellules cancéreuses du sein sensibles aux œstrogènes dans la moelle osseuse. Le modèle se compose de quelques éléments clés nécessaires à la dormance. Il s’agit notamment de 1) l’utilisation de cellules cancéreuses du sein sensibles aux œstrogènes, qui sont susceptibles de rester dormantes pendant de longues périodes, 2) l’incubation de cellules à densité clonogène, où l’interaction structurelle de chaque cellule se fait principalement avec le substrat, 3) la fibronectine, un élément structurel clé de la moelle osseuse et 4) le FGF-2, un facteur de croissance abondamment synthétisé par les cellules stromales de la moelle osseuse et fortement déposé dans la matrice extracellulaire. Les cellules incubées avec le FGF-2 forment des clones dormants après 6 jours, qui se composent de 12 cellules ou moins qui ont un aspect plat distinct, sont significativement plus grandes et plus étalées que les cellules en croissance et ont de grands rapports cytoplasme/noyau. En revanche, les cellules incubées sans FGF-2 forment principalement des colonies en croissance composées de >30 cellules relativement petites. Les perturbations du système avec des anticorps, des inhibiteurs, des peptides ou des acides nucléiques le 3e jour après l’incubation peuvent affecter de manière significative divers aspects phénotypiques et moléculaires des cellules dormantes à 6 jours et peuvent être utilisées pour évaluer les rôles des molécules localisées ou intracellulaires, des facteurs ou des voies de signalisation sur l’état dormant ou la survie des cellules dormantes. Tout en reconnaissant la nature in vitro de l’essai, il peut fonctionner comme un outil très utile pour recueillir des informations importantes sur les mécanismes moléculaires nécessaires à l’établissement et à la survie des cellules dormantes. Ces données peuvent être utilisées pour générer des hypothèses à tester sur des modèles in vivo.

Introduction

des cellules de cancer du sein à métastases de la moelle osseuse avant que la maladie est détectable ^1, dès que les tumeurs se développent de petits vaisseaux sanguins ^2,3. Le processus métastatique est rapide, mais inefficaces. Cellules entrent dans les nouveaux vaisseaux sanguins rapidement, à des millions par jour ⁴ mais peu survivent au voyage à des organes éloignés ^5. Néanmoins, certains micrométastases survivre dans l'os et peuvent être trouvés comme des cellules individuelles ou de petits amas de cellules dans les ponctions de moelle osseuse de patients nouvellement diagnostiqués ^1. Ces cellules résist....

Protocol

1. Test clonogénique

1. Préparer un seul suspensions de cellules de lignées de cellules de cancer du sein oestrogène-dépendante des cellules MCF-7 et T47D en suivant les étapes décrites ci-dessous
   1. Aspirer le milieu de culture (DMEM / 10% inactivé par la chaleur sérum de veau foetal / glutamine et pen / strep) à partir d'une boîte de culture tissulaire de 10 cm qui est non confluentes de cellules MCF-7 ou les cellules T-47D plus de 50%. Rincer avec du PBS. Incuber avec de la trypsine 0,25% / 2,21 mM EDTA dissout dans du DMEM riche en glucose à 37 ° C pendant 1-4 min.
   2. Voir les cellules à des intervalles de 1 min sous un microscope à contr....

Results

Des expériences ont été menées afin de récapituler l'essai. L'évolution dans le temps de l'expérience est représenté sur la figure 2A. Les cellules sont incubées à une densité clonogénique le jour -1, FGF-2 dans un milieu frais est ajouté au jour 0 et les cellules sont cultivées jusqu'au jour 6 quand ils sont colorés et les colonies sont comptées. Tous les perturbations du système sont administrés au jour 3 dans des volumes de 100 pi à 10x concentrations finales souhaitée. Figure 2B mon.......

Discussion

Notre modèle se compose de plusieurs éléments essentiels de dormance dans la moelle osseuse. Il se compose d'oestrogènes des cellules sensibles, qui sont du type susceptible de rester en sommeil dans la moelle pendant des périodes prolongées ^10, il se compose de la fibronectine, un élément structurel clé de la moelle, le FGF-2, un facteur de croissance abondamment synthétisée par le stroma de la moelle osseuse et fortement déposé dans la matrice extracellulaire de la moelle osseuse et ^31,32 inc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellules MCF-7	ATCC	HTB-22
Cellules T47D  ;	ATCC	HTB-123
BD BioCoat Fibronectine 24 puits clair à fond plat traité TC Plaque multipuits	Corning	354411
BD BioCoat Fibronectine 60 mm Boîtes de culture	Corning	354403
BD BioCoat Fibronectine 100 mm Boîtes de culture	Corning	354451
BD BioCoat 22x22mm #1 Couverture en verre avec une application uniforme de fibronectine	humaineCorning	354088
6 Well Plaque de culture tissulaire	CellTreat	229106
Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder	Corning Life Sciences	50-013-PB
Inactivé par la chaleur, fœtal Sérum sérique	Source International	FB02-500HI
0,25 % Trypsine/2,21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Solution de pénicilline-streptomycine, 100X	Corning	30-002-CI
L-Glutamine, 100x, Liquide	Corning	25-005-CI
FGF humain recombinant  ; R& de base	D Systems	234-FSE-025
Inhibiteur d’Akt (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycérocarbonate)	CalBiochem	124005
LY294002  ;	CalBiochem	19-142	Inhibiteur chenical de PI3K
C3 transférase  ;	Le cytosquelette	CTO3	inhibe RhoA, RhoB et RhoC, mais pas les GTPases apparentées telles que le dichlorhydrate Cdc42 ou Rac1
Y-27632.	Santa Cruz Biotechnology	129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (vert)  ;	Sondes moléculaires	B607	Fluorochrome pour la coloration de l’actine fibrillaire
BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (rouge)  ;	Sondes moléculaires	R415	Fluorochrome pour la coloration de l’actine fibrillaire
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Souris IgG Anticorps réactif, réactif ReadyProbes  ;	Sondes moléculaires	R37114
ProLong Gold Antifade Mountant avec DAPI  ;	Sondes moléculaires	P-36931