و، الفحص السلوكية قابلة غير مكلفة لقياس الإيثانول التخدير الحساسية والتسامح السريع في<em> ذبابة الفاكهة</em
Summary
Straightforward assays for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila facilitate the use of this model organism for investigating these important ethanol-related behaviors. Here, a relatively simple, scalable assay for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies is described.
Abstract
اضطراب تعاطي الكحول (AUD) هو التحدي صحية خطيرة. وعلى الرغم من عنصر وراثي كبير لAUD، وعدد قليل من الجينات قد تورطت بشكل لا لبس فيه في المسببات الخاصة بهم. ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة، هو نموذج قوي لاستكشاف الآليات الجزيئية الوراثية الكامنة وراء السلوكيات المتعلقة بالكحول، وبالتالي يحمل وعدا كبيرا لتحديد وفهم وظيفة الجينات التي تؤثر AUD. استخدام نموذج ذبابة الفاكهة لهذه الأنواع من الدراسات يعتمد على توافر فحوصات لقياس موثوق الاستجابات السلوكية لالايثانول. ويصف هذا التقرير مقايسة مناسبة لتقييم حساسية الايثانول والتسامح السريع في الذباب. ويتأثر حساسية الايثانول قياس في هذا الاختبار من خلال حجم وتركيز الإيثانول المستخدم، ومجموعة متنوعة من التلاعب الجيني ذكر سابقا، وأيضا طول الوقت ويعيش الذباب دون طعام مباشرة قبل الاختبار. في المقابل، الإيثانول الصورةلا يتأثر ensitivity قياس في هذا الاختبار من قبل قوة من معالجة الطاير، جنس الذباب، ومكملات متوسطة النمو مع المضادات الحيوية أو الخميرة الحية. وصفت ثلاث طرق مختلفة لquantitating حساسية الإيثانول، كل يؤدي إلى نتائج حساسية الإيثانول يمكن تمييزها بشكل أساسي. طبيعة قابلة للمن هذا الاختبار، جنبا إلى جنب مع بساطته الشاملة لانشاء ومنخفضة نسبيا حساب، وجعلها مناسبة لتحليل الصغيرة والكبيرة الحجم الوراثي للحساسية الايثانول والتسامح السريع في ذبابة الفاكهة.
Introduction
اضطراب تعاطي الكحول (AUD) هو مشكلة صحية هائلة في جميع أنحاء العالم (مراجعة في 1). على الرغم من أن آليات القيادة وتطوير AUD معقدة، هذه الاضطرابات لها عنصر وراثي كبير (على سبيل المثال، 2). والتوريث كبير من AUD والاستجابات السلوكية الحفظ إلى الايثانول عبر العديد من الأنواع (التي استعرضت في 3،4) قد ولدت اهتماما كبيرا في استخدام الكائنات نموذج الجينية للتحقيق في تورط جينات معينة في السلوكيات المرتبطة الايثانول نحو فهم أفضل لالأساس الجزيئي لل AUD. ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة، برزت كشركة رائدة كائن نموذج لاستكشاف الآليات الجزيئية الوراثية من السلوكيات المرتبطة الإيثانول (استعراضها في 3،4). وقد أبرزت الدراسات في الذباب الأدوار لعدة مسارات إشارات في الاستجابات السلوكية لالإيثانول (استعراضها في 5). يثير الاهتمام والفضول، وبعض من الجينات والممرات التي تؤثر على رد و السلوكيةكما تم توريط وفاق لالايثانول في الذباب في السلوكيات المرتبطة الايثانول القوارض و / أو AUD البشري (على سبيل المثال، 6-14). الحفاظ على آليات القيادة السلوكيات المرتبطة الإيثانول عبر الأنواع، إلى جانب مجموعة من الأدوات الجينية المتاحة في نظام نموذجي ذبابة الفاكهة، تؤكد فائدة نموذج ذبابة الفاكهة للتحقيق في علم الوراثة من الاستجابات السلوكية لالايثانول.
ويرتبط حساسية 15،16 والتسامح (استعراضها في 17) إلى الإيثانول في البشر في تطوير AUD. كل من هذه الاستجابات السلوكية لالإيثانول يمكن أن تكون على غرار في الذباب عن طريق مجموعة متنوعة من فحوصات المختبر (استعراضها في 3،4). تعتمد كل من المقايسات ذبابة معروفة للمؤلفين على أي تعتمد على الوقت الإيثانول الناجم عن التخدير / اتناسق أو الانتعاش تعتمد على الوقت من الإيثانول التخدير.
في مقال سابق من مجموعتنا على الوراثة من حساسية الايثانول و rالتسامح APID في ذبابة الفاكهة، تم استخدام الفحص السلوكي على أساس الايثانول التخدير الناجم عن بخار من الذباب (18). وقد بدأ اختبار في هذا الاختبار عن طريق نقل الكبار يعيش الذباب بدون تخدير لتفريغ قارورة الغذاء، ومحاصرة الذباب في قارورة مع المكونات خلات السليلوز، مضيفا الإيثانول إلى الأعلى (أي الجانب غير الطيران) من السليلوز خلات المكونات، و ختم القارورة التي تحتوي على الذباب، والسليلوز خلات التوصيل والايثانول مع سدادة سيليكون (انظر التخطيطي في الشكل S3، مرجع 18). تم تقييم قوارير متعددة تمثل مجموعات مختلفة من الذباب في موازاة ذلك، زيادة الإنتاجية من هذا الاختبار. أعطيت قارورة رمز المجهولين وتم أعمى المجربون لمجموعة العلاج لمنع التحيز غير المقصود في تقييم التخدير. في تجربة القياسية، الذباب في قارورة تم استغلالها بلطف في 6 دقائق فترات، وبعد الشفاء 30 ثانية، وقد أحصى عدد الذباب مخدرا في كل قارورة والمحولد أن الذباب النشطة في المئة. استوعبت الذباب الإيثانول بخار من المكونات خلات السليلوز بطريقة تعتمد على الوقت، مما تسبب في زيادات تدريجية في الإيثانول الداخلي 18 والتخدير (المرجع CF 18 و الشكل 1A و 1B في هذا التقرير). وقد تم تعريف التخدير في هذا الاختبار عمليا كما الذباب (ط) مكانة في غياب المشي أو (ب) الكذب على ظهورهم مع أو بدون ترفرف أجنحتها. هنا، يتم وصف هذا الإيثانول التخدير فحص بالتفصيل، يتم توفير مزيد من التحسين التشغيلي ذات الصلة لاستخدامه، ويستخدم في فحص لمعالجة مساهمة خيارات مكملات الغذائية على حساسية ذبابة التخدير.
Protocol
Representative Results
Discussion
المقايسات واضحة أن quantitate بتكاثر الظواهر ذات معنى هي ذات قيمة كبيرة لتحليل السلوك. العمل الموصوف هنا يتناول عدة جوانب العملية لفحص لقياس حساسية الايثانول التخدير والتسامح السريع في ذبابة الفاكهة. على الرغم من عدم التركيز لهذا العمل، وتسهيل التحليلات السلوكية م?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These studies were supported by grants from the National Institutes of Health, National Institute for Alcoholism and Alcohol Abuse to M.G. (P20AA017828, R01AA020634, P50 AA022537). The authors thank Jill Bettinger for helpful discussions and Jacqueline DeLoyht for technical assistance.
Materials
| food vials | VWR | 89092-772 | narrow |
| Flugs | Genesee/flystuff.com | 49-102 | narrow |
| silicone stopper | Fisher Scientific | 09-704-1l | #4 |
| ethanol | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
References
- Rehm, J., et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders. Lancet. 373, 2223-2233 (2009).
- Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).
- Scholz, H., Mustard, J. A. Invertebrate Models of Alcoholism. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 433-457 (2011).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A., Reilly, M. T., Lovinger, D. M. . Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism. 91, (2010).
- Schumann, G., et al. Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).
- Corl, A. B., et al. Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors. Cell. 137, 949-960 (2009).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436, 845-847 (2005).
- Riley, B. P., et al. Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample. Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).
- Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics. Génétique. 183, 733-745 (2009).
- Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster. Chemical senses. 35, 813-822 (2010).
- Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).
- Lind, P. A., et al. A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations. Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).
- Schuckit, M. A. Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism. The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).
- Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L. Alcohol tolerance. Ann Emerg Med. 15, 1005-1012 (1986).
- Chan, R. F., et al. Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays. Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).
- Eddison, M., et al. arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity. Neuron. 70, 979-990 (2011).
- Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).
- Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice. Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila. Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Maples, T., Rothenfluh, A. A simple way to measure ethanol sensitivity in flies. J Vis Exp. , e2541 (2011).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, 199-211 (2006).
- Rothenfluh, A., Troutwine, B. R., Ghezzi, A., Atkinson, N. S., Nohronha, A. Ch. 23. Neurobiology of Alcohol Dependence. 23, 467-495 (2014).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).
- Martin, I., Grotewiel, M. S. Oxidative damage and age-related functional declines. Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).
