Sélection de la taille Gel automatisé pour améliorer la qualité des bibliothèques de séquençage de prochaine génération Préparé à partir d&#39;échantillons d&#39;eau de l&#39;environnement

Miguel I. Uyaguari-Diaz; Jared R. Slobodan; Matthew J. Nesbitt; Matthew A. Croxen; Judith Isaac-Renton; Natalie A. Prystajecky; Patrick Tang

doi:10.3791/52685

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Article de méthode

Sélection de la taille Gel automatisé pour améliorer la qualité des bibliothèques de séquençage de prochaine génération Préparé à partir d'échantillons d'eau de l'environnement

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DOI :

10.3791/52685

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17 avril 2015

Miguel I. Uyaguari-Diaz¹ , Jared R. Slobodan² , Matthew J. Nesbitt² , Matthew A. Croxen³ , Judith Isaac-Renton¹^,³ , Natalie A. Prystajecky¹^,³ , Patrick Tang¹^,³

¹Department of Pathology and Laboratory Medicine, Faculty of Medicine, The University of British Columbia, ²Coastal Genomics, ³British Columbia Public Health Microbiology and Reference Laboratory

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit décrit une approche automatisée de sélection de la taille du gel pour purifier les fragments d’ADN pour le séquençage de nouvelle génération. La technologie Ranger permet une automatisation complète de l’ensemble du processus de chargement de gel d’agarose, d’analyse électrophorétique et de récupération de fragments d’ADN ciblés, ce qui permet d’obtenir des bibliothèques de séquençage de nouvelle génération à haut débit et de haute qualité.

Résumé

Le séquençage de nouvelle génération des échantillons environnementaux peut s’avérer difficile en raison de la quantité et de la qualité variables de l’ADN dans ces échantillons. Des banques d’ADN de haute qualité sont nécessaires pour obtenir des résultats optimaux du séquençage de nouvelle génération. Les échantillons environnementaux tels que l’eau peuvent avoir une mauvaise qualité et des quantités d’ADN médiocres, ainsi que des contaminants qui coprécipitent avec l’ADN. Les processus mécaniques et enzymatiques impliqués dans l’extraction et la préparation des banques peuvent endommager davantage l’ADN. La sélection de la taille du gel permet la purification et la récupération de fragments d’ADN d’une taille définie pour les applications de séquençage. Néanmoins, cette tâche est l’une des étapes les plus chronophages du flux de travail de préparation des banques d’ADN. Le protocole décrit ici permet l’automatisation complète du chargement de gel d’agarose, de l’analyse électrophorétique et de la récupération de fragments d’ADN ciblés.

Dans cette étude, nous décrivons une approche à haut débit pour préparer des banques d’ADN de haute qualité à partir d’échantillons d’eau douce qui peuvent également être appliqués à d’autres échantillons environnementaux. Nous avons utilisé une approche indirecte pour concentrer des cellules bactériennes à partir d’échantillons environnementaux d’eau douce ; L’ADN a été extrait à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN disponible dans le commerce, et les banques d’ADN ont été préparées à l’aide d’un protocole commercial basé sur des transposons. Des fragments d’ADN de 500 à 800 pb ont été sélectionnés en taille de gel à l’aide de la technologie Ranger, une station de travail d’électrophorèse automatisée. Le séquençage des banques d’ADN sélectionnées en fonction de la taille a démontré des améliorations significatives de la longueur de lecture et de la qualité des lectures de séquençage.

Introduction

La métagénomique implique le séquençage de tout le matériel génétique d’un échantillon pour caractériser les communautés microbiennes présentes. Il s’agit d’un processus complexe et coûteux qui implique la conversion des acides nucléiques extraits en banques d’ADN, suivie d’un séquençage de nouvelle génération. Des bibliothèques de haute qualité sont essentielles pour une sortie de données maximale et une analyse métagénomique précise. Les échantillons environnementaux, tels que les échantillons d’eau, posent souvent des défis importants pour générer des banques de haute qualité, en raison de faibles quantités d’ADN qui peuvent également être dégradés^1-3 et....