طريقة موحدة لتحليل خلايا الكبد خاص بالمنحنى البطانية وFenestrations من خلال المجهر الإلكتروني
Summary
The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.
Abstract
Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures – both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.
Introduction
الكبد الخلايا البطانية الجيبية (LSECs) هي غاية الخلايا البطانية المتباينة التي تبطن جدار جيبي الكبدي. ومثقبة LSECs مع fenestrations التي هي غير diaphragmed، العابر للالمسام 50-250 نانومتر في القطر. ما يصل الى 20٪ من سطح LSECs تغطيها fenestrations، التي عادة ما تكون في مجموعات من عشرات إلى مئات دعا لوحات غربال 1-3 (الشكل 1). Fenestrations سماح نقل البلازما وnanosubstrates بين الدم وخلايا الكبد، وخلق نظام الترشيح الفائق كفاءة عالية. Fenestrations هي البنى الدينامية – سواء من حيث الحجم و / أو رقم يمكن تغييرها استجابة لمختلف الدول الفسيولوجية، والمخدرات، والمرض. على سبيل المثال، fenestrations هي أكبر في صمت مما كانت عليه في الدولة التي تغذيها 4؛ 2-دي-iodoamphetamine يزيد عدد تنوفذ، 5،6 وانخفاض في حجم وعدد fenestrations في حدوث خلية في الشيخوخة والمرض العديد من الدول 13/7 </sup>. قياس دقيق لحجم وعدد fenestrations مهم لفهم كيفية تأثر LSEC التشكل المرض المختلفة، وسامة، والدول الفسيولوجية. تأثيرها على وظائف الكبد. ومن أجل تطوير تنوفذ تحوير التدخلات العلاجية 1.
دراسة fenestrations صعبة. قطر fenestrations يكمن تحت قرار من المجهر الضوئي التقليدي، لذلك فقد كان الوحيد سابقا الملاحظة باستخدام المجهر الإلكتروني في كل من أنسجة الكبد أو مثقف LSECs سليمة ممكن. وأكثر ما تم استخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لدراسة حجم تنوفذ والتردد والمسامية (النسبة المئوية للغشاء LSEC التي مخترقين fenestrations) لSEM يسمح لمراقبة مناطق واسعة من سطح البطانية وقياس الآلاف، إن لم يكن عشرات الآلاف من fenestrations. على الرغم من فائدتها، والنتائج التي أبلغ عنها من دراسات SEM المستندة لالمعلمات LSEC مثل حجم تنوفذ، عدد وتواتر والمسامية وتختلف على نطاق واسع في الأدب (الجدول 1).
Fenestrations ولوحات غربال هي الهياكل الهشة التي العقد، كسر، تمدد أو تلتحم خلال إعداد العينات، لا بد من معالجة بالتالي الحذر للحفاظ على سلامتهم. ارتفاع ضغط التروية 14؛ الأسمولية غير صحيحة من تثبيتي، ومخازن 15؛ عدم كفاية التثبيت أو التثبيت الزمن؛ وسرعة الجفاف بعد تثبيت وتجفيف كلها مجالات تجهيز لSEM التي قد تنتج القطع الأثرية التي تتداخل مع الحفاظ على التركيب الدقيق (الشكل 2). فقدان fenestrations ('القذف من النافذة') وتنوفذ انكماش يمكن أن يحدث نتيجة لسوء التثبيت، مما أدى إلى انخفاض قطرها تنوفذ والمسامية الخلية. وقد وصفت وسائل لتحسين الحفاظ على عينات لتحليل SEM سابقا 15-17 وسيتم مناقشتهاهنا مع نصائح إضافية حول كيفية تحسين الحفاظ على العينة. الأهداف الرئيسية لحفظ العينات هي لإزالة الدم من الجيوب بحيث يمكن تصور سطح LSEC وتجنب الضرر LSEC إما من ارتفاع ضغط أو تأخير التثبيت. نضح الكبد كاملة من تثبيتي عبر الوريد البابي هو الأسلوب المفضل لتثبيت الكبد. كما هو موضح بالتفصيل في مكان آخر يجب القيام 16،18 نضح تحت ضغط منخفض (على سبيل المثال 10 سم من H 2 0) لتجنب القطع الأثرية نضح المتعلقة الضغط والأضرار التي لحقت LSEC، والذي تجلى عادة فجوات كبيرة كما ضمن في غشاء الخلية. ومع ذلك، يمكن في كثير من الأحيان الحصول على تثبيت معقول باستخدام إبرة نضح من خزعات الكبد من البشر والحيوانات، كما هو موضح بالتفصيل في مكان آخر (19). تتضمن هذه التقنية عن طريق الحقن مباشرة تثبيتي إلى الأنسجة حتى يتم مسح الدم من العينة والنسيج حازم وثابت. تثبيت العينات للفحص المجهري الإلكترون يجب أن يكون الأداء الإقتصادي الأداءormed في أسرع وقت ممكن بعد وقف تدفق الدم لمنع التغييرات التركيبية التي تحدث نتيجة للكبد عمليات الانحلال الذاتي سريعة للغاية.
كما نقدم طريقة لتحليل الصور التي تقلل إدراج القطع الأثرية، وتوحد قياس fenestrations. وقد أدى الاختلاف في اختيار الجيوب لالميكروسكوب، تحليل الصور من القطع الأثرية، وقياس مساحة الخلية لالمسامية وتنوفذ تردد إلى تناقضات كبيرة في نشر النتائج. نهج موحد لتقييم وقياس fenestrations ومتطلبات الحد الأدنى لعرض البيانات لم يتم التطرق بوضوح في الأدب سابقا 4،10،20-31.
Protocol
Representative Results
Discussion
القدرة على بدقة وبتكاثر قياس حالة الكبد البطانة الجيبية هي خطوة هامة في فهم بيولوجيا هذه الخلايا المتخصصة للغاية. والتقنيات الحديثة مثل منظم إضاءة المجهر 32، قوة المجهر الذري 33 و D-STORM (مباشر الاستوكاستك البصرية Reconstrucion الميكروسكوب) 34 نقل المعلومات ا?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of material | Company | Catalogue Number | Comments |
| EM grade Glutaraldehyde | ProSciTech | C001 | Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze |
| Paraformaldehyde powder | Sigma Aldrich | 158127 | Always prepare Paraformaldehyde fresh |
| Sodium Cacodylate powder | Sigma Aldrich | C0250 | Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C1016 | Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O |
| Osmium tretroxide | ProSciTech | C011 | Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle |
| Ethanol- Absolute | Sigma Aldrich | 459836 | 100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve |
| Other grades of Ethanol | Labtech | EL5 | Prepare graded Ethanols with dH2O |
| Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 52619 | Allow to reach room temperature before use |
| Cannulas | Terumo | TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C | 18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice |
| Conductive Carbon tape | ProSciTech | IA0201 | |
| Carbon Paint | ProSciTech | I003 | |
| Ketamine | Must be optained under licence | ||
| Xylazine | Must be obtained under licence | ||
| Molecular Sieve | Sigma Aldrich | 208647 | Removes water from the 100 % Ethanol |
References
- Cogger, V. C., Le Couteur, D. G., Arias, I. M. . The Liver: Biology and Pathobiology. , 387-404 (2009).
- Fraser, R., Dobbs, B. R., Rogers, G. W. Lipoproteins and the liver sieve: the role of fenestrated sinusoidal endothelium in lipoprotein metabolism, atherosclerosis, and cirrhosis. Hepatology. 21, 863-874 (1995).
- Wisse, W., De Zanger, R. B., Charels, K., Van Der Smissen, P., McCuskey, R. S. The liver sieve: considerations concerning the structure and function of endothelial fenestrae, the sinusoidal wall and the space of Disse. Hepatology. 5 (4), 683-692 (1985).
- Reilly, J. N., Cogger, V. C., Fraser, R., Le Couteur, D. G. The effect of feeding and fasting on fenestrations in the liver sinusoidal endothelial cell. Pathology. 42 (3), 255-258 (2010).
- Tian, Y., et al. Activation of serotonin receptor-2B rescues small-for-size liver graft failure in mice. Hepatology. 53 (1), 253-262 (2011).
- Cogger, V. C., Mitchell, S. J., Warren, A., de Cabo, R., Le Couteur, D. G. Age-Related Loss of Responsiveness to 2,5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine in Liver Sinusoidal Endothelial Cells. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (5), 514-518 (2013).
- Reilly, J. N., Cogger, V. C., Le Couteur, D. G. Old age is associated with ultrastructural changes in isolated rat liver sinusoidal endothelial cells. J Electron Microsc. 59 (1), 65-69 (2010).
- Le Couteur, D. G., Rattan, A. E., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. . Calorie Restriction, Aging and Longevity. , 191-216 (2010).
- McLean, A. J., et al. Age-related pseudocapillarization of the human liver. J Pathol. 200 (1), 112-117 (2003).
- Le Couteur, D. G., et al. Pseudocapillarization and associated energy limitation in the aged rat liver. Hepatology. 33 (3), 537-543 (2001).
- Cogger, V. C., et al. The effect of acute oxidative stress on the ultrastructure of the perfused rat liver. Pharmacol Toxicol. 89 (6), 306-311 (2001).
- Horn, T., Christoffersen, P., Henriksen, J. H. Alcoholic liver injury: defenestration in noncirrhotic livers-a scanning electron microscopic study. Hepatology. 7 (1), 77-82 (1987).
- Jamieson, H. A., et al. Alterations in liver sinusoidal endothelium in a baboon model of type 1 diabetes. Diabetologia. 50 (9), 1969-1976 (2007).
- Fraser, R., et al. High perfusion pressure damages the sieving ability of sinusoidal endothelium in rat livers. Br J Exp Pathol. 61 (2), 222-228 (1980).
- Wisse, E. An electron microscopic study of the fenestrated endothelial lining of rat liver sinusoids. J Ultrastruct Res. 31 (1), 125-150 (1970).
- Wisse, E. An ultrastructural characterization of the endothelial cell in the rat liver sinusoid under normal and various experimental conditions, as a contribution to the distinction between endothelial and Kupffer cells. J Ultrastruct Res. 38 (5), 528-562 (1972).
- Fahimi, H. D. Perfusion and immersion fixation of rat liver with glutaraldehyde. Lab Invest. 16 (5), 736-750 (1967).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World J Gastroenterol. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Vreuls, C., et al. Jet-fixation: a novel method to improve microscopy of human liver needle biopsies. Hepatology. 59 (2), 737-739 (2014).
- Furrer, K., et al. Serotonin reverts age-related capillarization and failure of regeneration in the liver through a VEGF-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 108 (7), 2945-2950 (2011).
- Zhang, Q., et al. OxLDL induced injury and defenestration of HLSECs via LOX-1. J Mol Endocrinol. , (2014).
- May, D., et al. A transgenic model for conditional induction and rescue of portal hypertension reveals a role of VEGF-mediated regulation of sinusoidal fenestrations. PLoS One. 6 (7), e21478 (2011).
- Funyu, J., Mochida, S., Inao, M., Matsui, A., Fujiwara, K. VEGF can act as vascular permeability factor in the hepatic sinusoids through upregulation of porosity of endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 280 (2), 481-485 (2001).
- Venkatraman, L., Tucker-Kellogg, L. The CD47-binding peptide of thrombospondin-1 induces defenestration of liver sinusoidal endothelial cells. Liver Int. 33 (9), 1386-1397 (2013).
- Wack, K. E., et al. Sinusoidal ultrastructure evaluated during the revascularization of regenerating rat liver. Hepatology. 33 (9), 363-378 (2001).
- Morsiani, E., Mazzoni, M., Aleotti, A., Gorini, P., Ricci, D. Increased sinusoidal wall permeability and liver fatty change after two-thirds hepatectomy: An ultrastructural study in the rat. Hepatology. 21 (2), 539-544 (1995).
- Straub, A. C., et al. Arsenic-stimulated liver sinusoidal capillarization in mice requires NADPH oxidase–generated superoxide. J Clin Invest. 118 (12), 3980-3989 (2008).
- Barberá-Guillem, E., Arrue, J. M., Ballesteros, J., Vidal-Vanaclocha, F. Structural changes in endothelial cells of developing rat liver in the transition from fetal to postnatal life. JJ Ultrastruct Mol Struct Res. 97 (1-3), 197-206 (1986).
- Jamieson, H. A., et al. Caloric restriction reduces age-related pseudocapillarization of the hepatic sinusoid. Exp Gerontol. 42 (4), 374-378 (2007).
- Cogger, V. C., et al. Hyperlipidemia and surfactants: the liver sieve is a link. Atherosclerosis. 189 (2), 273-281 (2006).
- Cogger, V. C., et al. The effects of oxidative stress on the liver sieve. J Hepatol. 41 (3), 370-376 (2004).
- Cogger, V. C., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).
- Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells. J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).
- Monkemoller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).
