एक के रूप में ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव और Reoxygenation<em> इन विट्रो</em> Ischemia-reperfusion चोट मॉडल का अध्ययन रक्त मस्तिष्क बाधा शिथिलता के लिए
Summary
Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.
Abstract
Ischemia-reperfusion (आईआर) चोट इस्कीमिक स्ट्रोक के साथ जुड़े रुग्णता और मृत्यु दर में महत्वपूर्ण योगदान करने के लिए जाना जाता है। इस्केमिक मस्तिष्कवाहिकीय दुर्घटनाओं सभी स्ट्रोक के 80% के लिए खाते। आईआर चोट का एक आम कारण मुक्त कण के गठन को ट्रिगर के ऊतकों को रक्त, पोषक तत्वों, ऑक्सीजन की भारी / पुरानी रोड़ा निम्नलिखित तरल पदार्थ के तेजी से आमद है।
Ischemic स्ट्रोक रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) के रोग और vasogenic मस्तिष्क शोफ द्वारा पीछा किया जाता है। संरचनात्मक, endothelial कोशिकाओं के बीच तंग जंक्शनों (TJS) रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) की अखंडता को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। आईआर चोट एक गैर विशिष्ट, भड़काऊ प्रतिक्रिया के लिए अग्रणी एक प्रारंभिक माध्यमिक चोट है। सूजन निम्नलिखित ऑक्सीडेटिव और चयापचय तनाव बीबीबी पारगम्यता और तंग जंक्शन (टीजे) अखंडता के विघटन सहित माध्यमिक मस्तिष्क क्षति हो सके।
हमारी प्रोटोकॉल एक में इन विट्रो प्रस्तुत करता है </ उन्हें> चूहे के मस्तिष्क endothelial सेल टी जे अखंडता और तनाव फाइबर गठन पर ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव और reoxygenation (OGD-आर) के उदाहरण। वर्तमान में, विवो मॉडल में कई प्रयोगात्मक आईआर चोट के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं; हालांकि वे इस तरह के यंत्रवत रिश्तों का अध्ययन करने में सर्जरी, जीन निर्भर आणविक को प्रभावित करती है और कठिनाई का प्रदर्शन करने में तकनीकी चुनौतियों के रूप में कई सीमाएं हैं, कर सकते है। हालांकि, इन विट्रो मॉडल उन सीमाओं में से कई पर काबू पाने में सहायता कर सकते हैं। प्रस्तुत प्रोटोकॉल संभावित चिकित्सीय रणनीतियों प्रदान करने के लिए विभिन्न आणविक तंत्र और यंत्रवत रिश्तों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, इन विट्रो अध्ययन के परिणामों के vivo अध्ययन में मानक से भिन्न हो सकती है और सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए।
Introduction
Ischemia-reperfusion (आईआर) चोट स्ट्रोक, रोधगलन, आघात, परिधीय रोग और घाव मस्तिष्क चोट 1,2 के साथ जुड़े विभिन्न दुर्बल करने वाली जटिलताओं और मौतों की लगातार कारण हो पाया है। मस्तिष्क वाहिकाओं में आईआर चोट सूजन और शोफ 3 के लिए अग्रणी एक प्रारंभिक माध्यमिक चोट है। ऑक्सीडेटिव और सूजन को निम्नलिखित चयापचय तनाव का एक परिणाम के रूप में होता है कि गंभीर जटिलताओं में से एक समस्थिति मुफ्त कट्टरपंथी गठन के लिए अग्रणी संतुलन, रक्त मस्तिष्क बाधा में परिवर्तन (बीबीबी) तंग जंक्शनों (TJS) और microvascular पारगम्यता 4,5 का नुकसान हुआ है।
वर्तमान में, बीबीबी पर आईआर चोट के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल विवो मॉडल में मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा (MCAO), microembolism, और ट्रांसजेनिक या पीटा जानवरों शामिल हैं। Hossmann 6 से चर्चा के रूप में हालांकि, प्रत्येक अपनी कमियां और सीमाएं हैं। MCAO मॉडल effec अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता हैरेडॉक्स तनाव के टीएस, बीबीबी की junctional संचार में परिवर्तन और मस्तिष्क और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच बातचीत। हालांकि, वे इस तरह उसमें सटीक microsurgical प्रक्रियाओं और कठिनाइयों के लिए जरूरत के रूप में विभिन्न तकनीकी चुनौतियों प्रस्तुत करते हैं। मस्तिष्क ischemia अध्ययन करने के लिए ट्रांसजेनिक या पीटा जानवरों के इस्तेमाल रोधगलितांश गठन पर जीन पर निर्भर आणविक को प्रभावित करती है, नाड़ी शरीर रचना में परिवर्तन और बदलती शरीर के वजन 6 जैसी चुनौतियों हो सकता है, जबकि Microembolism तत्क्षण बीबीबी टूट जाती है। इसलिए, ischemia के इन विट्रो मॉडल दवाओं के लिए यंत्रवत अध्ययनों प्रदर्शन में होने के कारण उनके लागू करने के लिए मुख्य रूप से हाल के दिनों में बढ़ती रुचि मिल गया है। हालांकि, इन विट्रो अध्ययन के परिणामों को पूरी तरह से एक में vivo अध्ययन का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं और सावधानी 6 के साथ व्याख्या की जानी चाहिए।
Endothelial सेल monolayers और microvascular पारगम्यता पर कम ऑक्सीजन सांद्रता का प्रतिरोधी प्रभाव किया गया हैओगावा 7 से अध्ययन किया। चूहा मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं (RBMECs) में इन विट्रो बीबीबी विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव और reoxygenation (OGD-आर) तकनीक Zulueta एट अल और झू एट अल 8,9 द्वारा अध्ययन से अनुकूलित किया गया है। हम 0% ओ 2, 5% सीओ 2 और 95% एन 2 युक्त हाइपोक्सिया / अनॉक्सिता कक्ष में उन्हें रखने के द्वारा OGD-आर को मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं से अवगत कराया। प्रकोष्ठों बाद में क्रमशः इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्थानीयकरण और rhodamine phalloidin लेबलिंग का उपयोग टी जे अखंडता और तनाव फाइबर गठन में परिवर्तन के लिए मूल्यांकन किया गया। Zonula occludens -1 (ZO -1) के लिए immunofluorescence धुंधला ZO-1 के रूप में, टी जे अखंडता को निर्धारित करने के लिए किया जाता है टी जे प्रोटीन के लिए बाध्य एक महत्वपूर्ण मचान झिल्ली है। Rhodamine Phalloidin लेबलिंग सेल cytoskeleton में filamentous एक्टिन (च -actin) निर्धारित करता है और endothelial कोशिकाओं में actin तनाव फाइबर के गठन का एक स्पष्ट संकेत है।
<पी वर्ग = "jove_content"> इस पद्धति का लक्ष्य बीबीबी endothelial सेल टी जे अखंडता और एफ actin तनाव फाइबर के गठन का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो आईआर मॉडल के रूप में OGD-आर के विकास में अंतर्दृष्टि प्रदान करना है। परिणामों टी जे प्रोटीन के भाग्य के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं, ZO-1 और OGD-आर निम्न तनाव फाइबर गठन होगा। इन रिश्तों को समझना OGD-आर निम्नलिखित ट्रिगर कर रहे हैं कि अंतर्निहित आणविक तंत्र का निर्धारण और OGD-आर इलाज के बाद बीबीबी विघटन को बढ़ाने के लिए संभावित चिकित्सीय रणनीति विकसित करने का अवसर प्रदान करेगा।Protocol
Representative Results
Discussion
Ischemia-reperfusion की चोट के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में OGD-आर अच्छी तरह से न्यूरॉन्स 10,11 के अध्ययन के लिए स्थापित किया गया है। पारगम्यता और टी जे अखंडता 9 में मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं और परिवर्तन पर OGD का प?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम वित्तीय सहायता के लिए स्कॉट और व्हाइट अस्पताल रिसर्च ग्रांट कार्यक्रम को स्वीकार करते हैं और टेक्सास ए एंड लेजर confocal खुर्दबीन के उपयोग के लिए चिकित्सा एकीकृत इमेजिंग प्रयोगशाला के एम स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र कॉलेज। हम पांडुलिपि संपादन के साथ मदद के लिए श्री ग्लेन Cryer स्वीकार करते हैं।
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
References
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