Bir oksijen-Glukoz Yoksunluk ve reoksijenizasyonun<em> In Vitro</em> İskemi-Reperfüzyon Modeli incelenmesi Kan-Beyin Bariyeri Disfonksiyon için
Summary
Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.
Abstract
İskemi-Reperfüzyon (IR) hasarı, iskemik inmelerin ile ilişkili morbidite ve mortalite önemli ölçüde katkıda bilinmektedir. İskemik serebrovasküler kazalar tüm inmelerin% 80'ini oluşturmaktadır. IR yaralanma yaygın bir nedeni serbest radikallerin oluşumunu tetikleyen dokuya kan, besin, oksijen akut / kronik tıkanıklığı sonrası sıvıların hızlı girişi olduğunu.
İskemik inme, kan-beyin bariyerinin (KBB) disfonksiyonu ve vazojenik beyin ödemi takip eder. Yapısal olarak, endotel hücreleri arasında sıkı bağlantıları (TJs), kan-beyin bariyeri (BBB) bütünlüğünü muhafaza edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. IR hasarı spesifik olmayan, inflamatuar yanıt giden bir erken ikincil yaralanma. Inflamasyon aşağıdaki Oksidatif ve metabolik stres BBB geçirgenliği ve sıkı kavşak (TJ) bütünlüğünün bozulması da dahil olmak üzere ikincil beyin hasarı tetikler.
Bizim protokol bir in vitro sunar </ Em> sıçan beyin endotel hücre TJ bütünlüğü ve stres lif oluşumu üzerine oksijen glikoz mahrumiyet ve reoksijenizasyonun (OGD-R) örneği. Şu anda, in vivo modellerde çeşitli deneysel IR yaralanma etkilerini incelemek için kullanılır; ancak onlar böyle mekanik ilişkileri okuyan ameliyatlar, gen bağımlı moleküler etkileri ve zorluk performans teknik zorluklar gibi çeşitli sınırlamalar var. Bununla birlikte, in vitro modeller bu sınırlamaları birçok üstesinden yardımcı olabilir. sunulan protokol potansiyel terapötik stratejiler sağlamak için çeşitli moleküler mekanizmaları ve mekanik ilişkileri incelemek için kullanılabilir. Ancak, in vitro çalışmaların sonuçları in vivo çalışmalar, standart farklı olabilir ve dikkatle yorumlanmalıdır.
Introduction
İskemi-Reperfüzyon (IR) hasarı, inme, miyokard enfarktüsü, travma, periferik damar hastalığı ve travmatik beyin hasarı 1,2 ile ilişkili çeşitli zayıflatıcı komplikasyon ve ölüm sık nedeni olarak bulunmuştur. Serebral damarlarda IR yaralanma inflamasyon ve ödem 3 giden bir erken ikincil yaralanma. Oksidatif ve enflamasyon, aşağıdaki metabolik stres sonucu ortaya çıkan ciddi komplikasyonların bir homeostatik serbest radikal oluşumuna yol açan bir denge, kan-beyin bariyerinin değişiklikler (BBB) sıkı bağlantıları (TJs) ve mikrovasküler geçirgenliğin 4,5 kaybıdır.
Şu anda, BBB üzerindeki IR yaralanma etkilerini incelemek için kullanılan in vivo modellerde orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO), mikroembolizm ve transgenik veya nakavt hayvanları kapsar. Hossmann 6 tartıştığı Ancak, her biri kendi dezavantajları ve sınırlamaları vardır. MCAO modeli effec incelemek için kullanılırRedoks stres ts, BBB kavşak iletişimde değişiklikler ve beyin ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimler. Ancak, bu tür içinde hassas mikrocerrahi prosedürleri ve zorluklar için ihtiyaç olarak çeşitli teknik sorunlar mevcut. Serebral iskemi incelemek için transgenik ya da nakavt hayvanların kullanımı enfarktüs oluşumu gen bağımlı moleküler etkileri, vasküler anatomi değişiklikler ve değişen vücut ağırlıkları 6 gibi zorlukları olabilir iken mikroembolisinden anında BBB yıkar. Bu nedenle, iskemi in vitro modeller ilaçlar için mekanistik çalışmalar yapmak nedeniyle uygulanabilirlikleri esas olarak son zamanlarda ilgi artmaktadır bulduk. Ancak, in vitro çalışmaların sonuçları tam bir in vivo çalışma temsil etmeyebilir ve dikkatli 6 yorumlanması gerekir.
Endotelyal hücre tek tabakalarında ve mikrovasküler geçirgenliğin düşük oksijen konsantrasyonları gibi karşı etkisi olmuşturOgawa 7 tarafından incelenmiştir. Fare beyni mikrovasküler endotelyal hücreleri (RBMECs), in vitro BBB geliştirmek için kullanılmıştır. Bu protokol sunulan oksijen glikoz mahrumiyet ve reoksijenizasyonun (OGD-R) tekniği Zulueta ark ve Zhu ve ark 8,9 ile çalışmalarda adapte edilmiştir. Biz% 0 O 2,% 5 CO2 ve% 95 N 2 içeren bir hipoksi / anoksi odasına yerleştirerek OGD-R beyin endotel hücrelerini gözler önüne serdi. Hücreler daha sonra sırasıyla immunofloresan lokalizasyonu ve rodamin Phalloidin etiketleme kullanarak TJ bütünlüğü ve stres lif oluşumu değişiklikler açısından değerlendirildi. Zonula okludinler-1 (ZO-1) için immünofloresan boyama ZO-1 gibi, TJ bütünlüğünü saptamak için gerçekleştirilir TJ proteine bağlı önemli bir iskele membrandır. Rodamin Phalloidin etiketleme hücre iskeletinin içinde ipliksi aktin (f-aktin) belirler ve endotel hücreleri aktin stres lif oluşumu açık bir göstergesidir.
<p class = "jove_content"> Bu yöntemin amacı, BBB endotel hücre TJ bütünlüğü ve F-aktin stres lif oluşumu çalışmak için in vitro bir model olarak İR OGD-R geliştirilmesi hakkında fikir temin edilmesidir. Sonuçlar TJ protein kaderi hakkında bilgi vermek, ZO-1 ve OGD-R aşağıdaki stres lif oluşumu olacaktır. Bu ilişkileri anlamak OGD-R aşağıdaki tetiklemeli olan altta yatan moleküler mekanizmaları belirlemek ve OGD-R tedavisi sonrasında BBB kesintileri artırmak için potansiyel terapötik stratejiler geliştirmek için bir fırsat sağlayacaktır.Protocol
Representative Results
Discussion
Işemi-reperfüzyon yaralanması için bir in vitro model olarak OGD-R de nöronlar 10,11 çalışmak için kurulmuştur. Geçirgenlik ve TJ bütünlük 9 beyin endotel hücreleri ve değişiklikler üzerinde OGD'ye etkisini gösteren çalışmalar da vardır. Ancak, bizim çalışmamız aşağıdaki iskemik inme meydana in vivo koşullarda iskemik reperfüzyon hasarı daha yakından temsilidir OGD'ye etkisi yanı sıra yeniden oksijenasyonunu gösterir.
<p class="jove…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz mali destek için Scott Beyaz Hastanesi Araştırma Hibeler Programı kabul ve Texas A & konfokal lazer mikroskobu kullanımı için Tıp Entegre Görüntüleme Laboratuvarı M Sağlık Bilim Merkezi Koleji. Biz el yazması düzenleme ile yardım için Sayın Glen Cryer kabul etmiş sayılırsınız.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion–from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
- Yang, X., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats. Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).
- Kaur, C., Ling, E. A. Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions. Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).
- Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke. Neurology. 79 (13), S52-S57 (2012).
- Hossmann, K. A. Experimental models for the investigation of brain ischemia. Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).
- Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties. J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).
- Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation. Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).
- Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
- Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation. J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).
- Gundimeda, U., et al. Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon. J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).
- Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).
- Alluri, H., et al. Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation. Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).
- Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability. Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin. J Vis Exp. (57), (2011).
