العظام مكيفة المتوسطة: إعداد والأحيائي
Summary
وصفنا هنا كيفية إعداد المتوسطة مكيفة العظام (BCM) واختبار نشاطه في المختبر.
Abstract
وتستخدم على نطاق واسع ترقيع العظام ذاتي في الفم والوجه والفكين جراحة، طب العظام، والكسور. ترقيع العظام ذاتي ليس فقط استبدال العظام في عداد المفقودين، كما أنها تدعم عملية معقدة من تجديد العظام. ويعزى هذا السلوك مواتية لطعم ذاتي لخصائص ثلاثة: osteoconductivity، osteogenicity، وosteoinductivity. ومع ذلك، هناك جانب آخر: العظام ترقيع الافراج عن عدد لا يحصى من الجزيئات، بما في ذلك عوامل النمو، والتي يمكن أن تستهدف خلايا اللحمة المتوسطة العاملة في تجديد العظام. خصائص نظير الصماوي من ترقيع العظام يمكن دراستها في المختبر عن طريق استخدام المتوسطة مكيفة العظام (BCM). هنا نقدم بروتوكول بشأن كيفية إعداد المتوسطة مكيفة العظام من الأصلي القشرية خنزير العظام، والعظام التي خضعت المعالجة الحرارية أو التنقية. الخلايا يمكن أن يتعرض مباشرة لBCM أو المصنف على المواد الحيوية، مثل الأغشية الكولاجين، غارقة في السابق مع BCM. نعطي أمثلة لفي المختبر bioassaيس مع خلايا اللحمة المتوسطة على التعبير عن TGF-β الجينات تنظيمها. يجب على البروتوكولات المعروضة يشجع على مواصلة الكشف عن الآثار نظير الصماوي من ترقيع العظام أثناء تجديد العظام وفتح مسار للأبحاث متعدية في مجال واسع من الجراحة الترميمية.
Introduction
ويستخدم على نطاق واسع العظم ذاتي لسد العيوب التي حدثت نتيجة للتشوه، جراحة resective، والجراحة الترميمية الصدمة، وقبل الزرع وضع 1،2. فهم المبادئ البيولوجية لكيفية دعم ترقيع العظام عملية الكسب غير المشروع التوحيد ليست المفتاح الوحيد لفهم لماذا تعتبر طعم ذاتي لتكون معيار الذهب في الجراحة الترميمية، بل هو أيضا الكترونية لتصميم محسن للبدائل العظام 3. ومع ذلك، الكسب غير المشروع توحيد أسرع مع العظم ذاتي مقارنة بدائل العظام 4،5. وبالتالي، لا بد من الكشف عن الآليات الجزيئية والخلوية التي تجعل العظام ذاتي فعالة جدا لدعم تجديد العظام.
هناك ثلاث خصائص الكتاب المدرسي لطعم ذاتي التي تعتبر لدعم 6،7 عملية الدمج. الأول، هو العظم ذاتي عظمي، وتوفير التوجيه للالعظام التي شكلت حديثا في النموإلى الخلل. ثانيا، العظام ذاتي هو المكونة للعظم، وهذا يعني أنه يحتوي على خلايا اللحمة المتوسطة التي يمكن أن تفرق في بانيات 8. الثالث، العظام ذاتي هو osteoinductive كما عوامل النمو مثل البروتينات مخلق العظام مدفون في المصفوفة يمكن الشروع في عملية داخل الغضروف أو حتى الغشائي تكوين العظام 9. وهناك جانب آخر: رقائق العظام الطازجة عقد وظيفة نظير الصماوي استنادا إلى الملاحظات في المختبر مع "المتوسطة مكيفة العظام" 10-15. كما أثر تكون النقويات تجدر الإشارة 16. مصطلح مماثل "العظام المنزوعة المعادن مكيفة مصفوفة المتوسطة" التي صيغت بالفعل في 1996 ويدعم مفهوم شامل وظيفة نظير الصماوي من العظام، وحتى عندما يتم معالجتها من قبل التنقيه 17. لأغراضنا، BCM يمكن إعداد من الخنزير الطازج الفك السفلي 10،11. وكشفت التحليلات البروتين من BCM تكوين معقد، بما في ذلك حقيقة النموالأملاح ومكونات المصفوفة خارج الخلية 10، وتمتد أيضا المعرفة القائمة على proteasome والعظام كله 18،19. وبالتالي، يجب BCM تعكس النشاط التي تم إصدارها من تعديلات مختلفة من الطعوم العظمية في المختبر.
ماذا يحدث عندما تتعرض الخلايا الوسيطة، على سبيل المثال تلك المعزولة من رقائق العظام أو من الأنسجة اللينة عن طريق الفم، لBCM؟ في المختبر، BCM يقلل المكونة للعظم والتمايز مكون الشحم، ويثير زيادة ملحوظة في عدد IL11 التعبير 11. الجينوم كشف ميكروأري واسعة أكثر من الجينات أن أعرب تفاضلي في خلايا اللحمة المتوسطة ردا على BCM. من بين هذه الجينات هي adrenomedullin (ADM)، IL11، IL33، NADPH أوكسيديز 4 (NOX4)، بروتيوغليكان 4 (PRG4، أو lubricin) وpentraxin 3 (PTX3) 15. BCM تم الحصول عليها من رقائق العظام تعقيمها فشلت في تغيير تعبير عن الجينات المعنية 14. كان BCM من رقائق العظام التي خضعت البسترة وتجميد قادرة علىتغيير التعبير الجيني 14. متوسطة مكيفة أيضا مصفوفة العظام المنزوعة (DBM-CM) يتغير التعبير عن TGF-β تنظيم الجينات 20. ومن المثير للاهتمام، والأغشية حاجز الكولاجين تستخدم لحماية رقائق العظام من الأنسجة الرخوة المحيطة 21،22، كثف تلك الأجزاء من BCM التي هي المسؤولة عن التغيرات في التعبير الجيني 23. ويمكن تمديد البحوث BCM إلى أنواع الخلايا الأخرى المشاركة في تجديد العظام مثل الآكلة-resorbing العظام والخلايا البطانية، على سبيل المثال لا الحصر. وبصفة عامة فإن البيانات في المختبر تراكم الأساس العلمي لتصميم دراسة ما قبل السريرية.
هذا البروتوكول ذو شقين: أولا، لكنه يظهر كيفية تحضير BCM. ثانيا، فإنه يظهر كيفية اختبار النشاط البيولوجي التي تقوم على خلايا اللحمة المتوسطة في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
مكيفة العظام المتوسطة يعكس النشاط التي تم إصدارها من ترقيع العظام خلال المراحل الأولى من تجديد العظام. بروتوكول الموصوفة هنا يمكن تكييفها لدراسة استجابة من أنواع مختلفة من الخلايا المشاركة في تجديد العظام. وعلاوة على ذلك، فإن بروتوكول يمكن استخدامها لإعداد المتوسط…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Catherine Solioz for her skillful assistance.
Materials
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
References
- Buser, D. Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation. Journal of dental research. , (2013).
- Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M. augmentation procedures in implant dentistry. The International journal of oral & maxillofacial implants. 24 Suppl. , 237-259 (2009).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E. substitutes: an update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27. , (2005).
- Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).
- Jensen, S. S. Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).
- Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).
- Khan, S. N. The biology of bone grafting. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 13, 77-86 (2005).
- Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery. British. 50, 866-873 (1968).
- Bone Urist, M. R. formation by autoinduction. Science. 150, 893-899 (1965).
- Caballé-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium. The International journal of oral & maxillofacial implants. , (2014).
- Peng, J. Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro. Clinical implant dentistry and related research. , (2014).
- Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study. Clinical oral implants research. , (2014).
- Caballé-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Zimmermann, M. Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts). IJOMI accepted. , (2014).
- Fulzele, K. Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling. Blood. 121, 930-939 (2013).
- Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor. Journal of. 11, 1703-1714 (1996).
- Kupcova Skalnikova, ., H, Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome. Biochimie. , (2013).
- Romanello, M. Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment. , (2013).
- Schuldt Filho, ., G, Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-β signaling pathways in mesenchymal cells in vitro. J Cranio Maxill Surg. , (2015).
- Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures). The International journal of periodontics & restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).
- Stoecklin-Wasmer, C. Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review. Journal of dental research. 92, 773-781 (2013).
