Кость кондиционированной среды: Подготовка и биопроб
Summary
Мы описываем здесь, как подготовить кости кондиционером среду (BCM) и проверить его деятельность в пробирке.
Abstract
Аутологичные костные трансплантаты широко используется в челюстно-лицевой хирургии, ортопедии, травматологии и. Аутологичные костные трансплантаты не только заменить отсутствующий кости, они также поддерживают сложный процесс регенерации костной ткани. Это благоприятное поведение аутотрансплантатов объясняется тремя характеристиками: Остеокондуктивность, osteogenicity и остеоиндуктивность. Тем не менее, есть еще один аспект: костные трансплантаты выпустить множество молекул, в том числе факторов роста, которые могут предназначенных мезенхимных клеток, участвующих в регенерации кости. Паракринной свойства костных трансплантатов могут быть изучены в пробирке с использованием костно-кондиционированной среды (БМВ). Здесь мы приводим протокол о том, как подготовить среду кости кондиционером из родного свинья кортикальной кости, и кости, что подвергся термической обработке или деминерализации. Клетки могут быть непосредственно подвергаются BCM или высевали биоматериалов, таких как коллаген мембраны, ранее пропитанных BCM. Приведем примеры для в пробирке bioassaYS с мезенхимных клеток на экспрессию TGF-β регулируемых генов. Представленные протоколы должны поощрять дальнейшее выявить паракринные эффекты костные трансплантаты во время регенерации костной и открыть путь для трансляционных исследований в широкой области реконструктивной хирургии.
Introduction
Аутокостью широко используется для преодоления недостатков, которые произошли в результате пороков развития, resective хирургии, реконструктивной хирургии травмы и до имплантации 1,2. Понимание биологических принципов, как кости трансплантаты поддерживает процесс консолидации трансплантата является не только ключом к пониманию, почему аутографты считаются золотым стандартом в реконструктивной хирургии, это также бионической улучшенной конструкции костных заменителей 3. Тем не менее, консолидация трансплантата быстрее аутокостью сравнению с костной заменяет 4,5. Таким образом, крайне важно выявить молекулярные и клеточные механизмы, которые делают аутокостью так эффективной поддержки регенерации костной ткани.
Есть три учебника характеристики аутотрансплантатов, считающихся поддерживает процесс консолидации 6,7. Во-первых, аутологичных кости остеокондуктивным, обеспечивая руководство для вновь образованной кости растив дефект. Во-вторых, аутологичной кости остеогенная, что означает, что она содержит мезенхимальные клетки, которые могут дифференцироваться в остеобласты 8. В-третьих, аутологичных кости остеоиндуктивный, как факторы роста, такие как морфогенетические белки кости погребенных в матрице может инициировать процесс эндохондральных или даже Intramembranous формирования костной 9. Существует еще один аспект: свежеприготовленные чипсы кости провести паракринную функцию, основанную на наблюдениях в пробирке с "средней кости кондиционером" 10-15. Кроме воздействие миелопоэза Следует отметить, 16. Аналогичный термин "матрица с кондиционером среднего деминерализованной кости" уже придуман в 1996 году и поддерживает общую концепцию паракринным функции костей, даже при обработке деминерализации 17. Для наших целей, BCM могут быть получены из свежего свиньи Мандибулы 10,11. Протеомные анализы показали, BCM сложный состав, в том числе то, ростаПРС и компоненты внеклеточного матрикса 10, также расширяет существующие знания на протеасоме всей кости 18,19. Таким образом, BCM должен отражать выпущенный активность различных модификаций костные трансплантаты в пробирке.
Что происходит, когда мезенхимальные клетки, например, выделенные из костной стружки или из мягкой ткани полости рта, подвергаются BCM? В пробирке, BCM уменьшает остеогенной дифференцировки и Adipogenic, и провоцирует сильное увеличение экспрессии IL11 11. Геном шириной микрочипов показали несколько генов, которые будут по-разному выражается в мезенхимальных клеток в ответ на ВСМ. Среди этих генов адреномедуллин (АДМ), IL11, IL33, НАДФН-оксидазы (4 NOX4), протеогликан 4 (PRG4 или лубрицином) и pentraxin 3 (PTX3) 15. BCM получены из автоклавного фишек кости не удалось изменить выражение соответствующих генов 14. BCM от кости чипов, которые прошли пастеризацию и замораживание удалосьизменить экспрессию генов 14. Также кондиционером среднего деминерализованной костной матрицы (ДКМ-CM) изменяет экспрессию TGF-β-регулируемых генов 20. Интересно, что коллаген барьерные Мембраны, используемые для защиты кусочков кости от окружающих мягких тканей 21,22, адсорбированный те части ВСМ, которые отвечают за изменений в экспрессии генов 23. BCM исследования могут быть распространены на другие типы клеток, участвующих в регенерации кости, такие как кости резорбции остеокластов и эндотелиальных клеток, чтобы назвать несколько. В целом, данные накапливаются в пробирке обеспечить научную основу для дизайна доклинических исследований.
Настоящий Протокол два: во-первых, он показывает, как подготовить BCM. Во-вторых, она показывает, как проверить его биологическую активность на основе мезенхимальных клеток в пробирке.
Protocol
Representative Results
Discussion
Кость кондиционером среднего отражает выпущен деятельность костных имплантатов во время ранних стадиях регенерации костной ткани. Протокол, описанный здесь, может быть адаптирован для изучения реакции различных типов клеток, участвующих в регенерации кости. Кроме того, протокол мож?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Catherine Solioz for her skillful assistance.
Materials
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
References
- Buser, D. Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation. Journal of dental research. , (2013).
- Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M. augmentation procedures in implant dentistry. The International journal of oral & maxillofacial implants. 24 Suppl. , 237-259 (2009).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E. substitutes: an update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27. , (2005).
- Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).
- Jensen, S. S. Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).
- Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).
- Khan, S. N. The biology of bone grafting. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 13, 77-86 (2005).
- Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery. British. 50, 866-873 (1968).
- Bone Urist, M. R. formation by autoinduction. Science. 150, 893-899 (1965).
- Caballé-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium. The International journal of oral & maxillofacial implants. , (2014).
- Peng, J. Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro. Clinical implant dentistry and related research. , (2014).
- Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study. Clinical oral implants research. , (2014).
- Caballé-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Zimmermann, M. Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts). IJOMI accepted. , (2014).
- Fulzele, K. Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling. Blood. 121, 930-939 (2013).
- Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor. Journal of. 11, 1703-1714 (1996).
- Kupcova Skalnikova, ., H, Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome. Biochimie. , (2013).
- Romanello, M. Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment. , (2013).
- Schuldt Filho, ., G, Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-β signaling pathways in mesenchymal cells in vitro. J Cranio Maxill Surg. , (2015).
- Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures). The International journal of periodontics & restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).
- Stoecklin-Wasmer, C. Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review. Journal of dental research. 92, 773-781 (2013).
