अस्थि वातानुकूलित माध्यम: तैयारी और Bioassay
Summary
हम हड्डी वातानुकूलित मध्यम (बीसीएम) तैयार करने और इन विट्रो में अपनी गतिविधि का परीक्षण करने के लिए कैसे यहाँ का वर्णन।
Abstract
ऑटोलॉगस हड्डी ग्राफ्ट व्यापक रूप से मौखिक और मैक्सिलोफैशियल सर्जरी, हड्डी रोग, और Traumatology में उपयोग किया जाता है। ऑटोलॉगस हड्डी grafts ही लापता हड्डी की जगह नहीं है, वे भी हड्डी पुनर्जनन की जटिल प्रक्रिया का समर्थन है। Autografts का यह अनुकूल व्यवहार तीन विशेषताओं के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है: osteoconductivity, osteogenicity, और osteoinductivity। बहरहाल, एक अन्य पहलू है: अस्थि हड्डी पुनर्जनन में शामिल mesenchymal कोशिकाओं को लक्षित कर सकते हैं जो वृद्धि कारकों, सहित अणुओं के असंख्य जारी grafts। हड्डी grafts के पैराक्राइन गुण हड्डी वातानुकूलित मध्यम (बीसीएम) के उपयोग से इन विट्रो में अध्ययन किया जा सकता है। यहाँ हम थर्मल प्रसंस्करण या विखनिजीकरण कराना पड़ा कि एक देशी सुअर cortical हड्डी से हड्डी वातानुकूलित मध्यम तैयार करने के बारे में प्रोटोकॉल, और हड्डी प्रस्तुत करते हैं। कोशिकाओं को सीधे बीसीएम के संपर्क में या ऐसे कोलेजन झिल्ली, पहले से बीसीएम से लथपथ के रूप में biomaterials, पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है। हम इन विट्रो bioassa के लिए उदाहरण देTGF-β विनियमित जीनों की अभिव्यक्ति पर mesenchymal कोशिकाओं के साथ वाईएस। प्रस्तुत प्रोटोकॉल आगे हड्डी उत्थान के दौरान हड्डी grafts के पैराक्राइन प्रभाव का पता चलता है और पुनर्निर्माण सर्जरी के व्यापक क्षेत्र में शोधों के लिए एक रास्ता खोलने के लिए प्रोत्साहित करना चाहिए।
Introduction
ऑटोलॉगस हड्डी व्यापक रूप से एक कुरूपता का परिणाम, resective सर्जरी, पुनर्निर्माण आघात सर्जरी, और पूर्व इम्प्लांट प्लेसमेंट 1,2 करने के लिए के रूप में हुई है कि दोषों को पाटने के लिए प्रयोग किया जाता है। हड्डी ग्राफ्ट भ्रष्टाचार के समेकन की प्रक्रिया का समर्थन कैसे की जैविक सिद्धांतों को समझने autografts पुनर्निर्माण सर्जरी में स्वर्ण मानक माना जाता है समझने के लिए क्यों केवल महत्वपूर्ण नहीं है, यह भी हड्डी के विकल्प 3 के बेहतर डिजाइन करने के लिए बायोनिक है। फिर भी, भ्रष्टाचार समेकन तेजी ऑटोलॉगस हड्डी के साथ हड्डी 4,5 विकल्प की तुलना में है। इस प्रकार, यह हड्डी पुनर्जनन समर्थन करने के लिए बहुत प्रभावी ऑटोलॉगस हड्डी बना है कि आणविक और सेलुलर तंत्र प्रकट करने के लिए आवश्यक है।
समेकन की प्रक्रिया 6,7 समर्थन करने के लिए माना जाता है कि autografts के तीन पाठ्यपुस्तक विशेषताएं हैं। सबसे पहले, ऑटोलॉगस हड्डी विकसित करने के लिए नवगठित हड्डी के लिए मार्गदर्शन प्रदान करने, osteoconductive हैदोष में। दूसरे, ऑटोलॉगस हड्डी यह अस्थिकोरक 8 में अंतर कर सकते हैं कि mesenchymal कोशिकाओं में शामिल है जिसका अर्थ है कि osteogenic है। मैट्रिक्स में entombed हड्डी morphogenetic प्रोटीन की तरह वृद्धि कारकों endochondral या यहां तक कि intramembranous हड्डी गठन 9 की प्रक्रिया शुरू कर सकते हैं के रूप में तीसरा, ऑटोलॉगस हड्डी osteoinductive है। एक और पहलू है: हौसले से तैयार हड्डी चिप्स "हड्डी वातानुकूलित मध्यम" 10-15 के साथ इन विट्रो टिप्पणियों पर आधारित एक पैराक्राइन समारोह का आयोजन करेगा। इसके अलावा myelopoiesis का प्रभाव 16 उल्लेख किया जाना चाहिए। "Demineralized हड्डी मैट्रिक्स वातानुकूलित मध्यम" एक समान अवधि पहले से ही विखनिजीकरण 17 से संसाधित, तब भी जब 1996 में गढ़ा और हड्डी के एक पैराक्राइन समारोह की समग्र अवधारणा का समर्थन किया गया था। हमारे उद्देश्यों के लिए, बीसीएम 10,11 mandibles ताजा सुअर से तैयार किया जा सकता है। बीसीएम की प्रोटिओमिक विश्लेषण के विकास तथ्य सहित जटिल संरचना का पता चलाअन्य रैंकों और बाह्य मैट्रिक्स 10 के घटक है, यह भी पूरी हड्डी 18,19 के Proteasome पर मौजूदा ज्ञान का विस्तार। इस प्रकार, बीसीएम इन विट्रो में हड्डी grafts के विभिन्न संशोधनों की जारी की गतिविधि को प्रतिबिंबित करना चाहिए।
Mesenchymal कोशिकाओं, उदाहरण के हड्डी चिप्स से या मौखिक नरम ऊतक से अलग उन लोगों के लिए, बीसीएम के लिए? इन विट्रो उजागर कर रहे हैं क्या होता है जब, बीसीएम osteogenic और adipogenic भेदभाव को कम कर देता है, और IL11 अभिव्यक्ति 11 की एक मजबूत वृद्धि भड़काती। जीनोम चौड़ा माइक्रोएरे विभिन्न बीसीएम के जवाब में mesenchymal कोशिकाओं में व्यक्त किया जा करने के लिए और अधिक जीन का पता चला। इन जीनों के बीच Adrenomedullin (एडीएम) कर रहे हैं, IL11, IL33, एनएडीपीएच ओक्सीडेस 4 (NOX4), proteoglycan 4 (PRG4, या lubricin) और 3 (PTX3) 15 pentraxin। Autoclaved हड्डी चिप्स से प्राप्त बीसीएम संबंधित जीन 14 की अभिव्यक्ति को बदलने में नाकाम रहे। Pasteurization कराना पड़ा और ठंड कि हड्डी चिप्स से बीसीएम करने में सक्षम थाजीन अभिव्यक्ति 14 बदल जाते हैं। Demineralized हड्डी मैट्रिक्स (डी बी-मुख्यमंत्री) के अलावा वातानुकूलित माध्यम TGF-β विनियमित जीन 20 की अभिव्यक्ति बदल जाता है। दिलचस्प है, आसपास के कोमल ऊतक 21,22 से हड्डी चिप्स ढाल करने के लिए इस्तेमाल किया कोलेजन बाधा झिल्ली, जीन अभिव्यक्ति 23 में परिवर्तन के लिए जिम्मेदार हैं कि बीसीएम के उन हिस्सों adsorbed। बीसीएम अनुसंधान के लिए कुछ नाम, जैसे हड्डी-resorbing osteoclasts और endothelial कोशिकाओं के रूप में हड्डी पुनर्जनन में शामिल अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए बढ़ाया जा सकता है। कुल मिलाकर, जमते इन विट्रो डेटा एक पूर्व नैदानिक अध्ययन के डिजाइन के लिए वैज्ञानिक आधार प्रदान करते हैं।
वर्तमान प्रोटोकॉल दो गुना है: सबसे पहले, यह बीसीएम तैयार करने के लिए कैसे पता चलता है। दूसरे, यह इन विट्रो में mesenchymal कोशिकाओं के आधार पर अपने जैविक गतिविधि का परीक्षण करने के लिए दिखाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
अस्थि-वातानुकूलित माध्यम हड्डी उत्थान के प्रारंभिक दौर के दौरान हड्डी ग्राफ्ट की जारी की गतिविधि को दर्शाता है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल हड्डी पुनर्जनन में शामिल कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार की प्रतिक?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Catherine Solioz for her skillful assistance.
Materials
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
References
- Buser, D. Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation. Journal of dental research. , (2013).
- Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M. augmentation procedures in implant dentistry. The International journal of oral & maxillofacial implants. 24 Suppl. , 237-259 (2009).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E. substitutes: an update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27. , (2005).
- Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).
- Jensen, S. S. Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).
- Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).
- Khan, S. N. The biology of bone grafting. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 13, 77-86 (2005).
- Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery. British. 50, 866-873 (1968).
- Bone Urist, M. R. formation by autoinduction. Science. 150, 893-899 (1965).
- Caballé-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium. The International journal of oral & maxillofacial implants. , (2014).
- Peng, J. Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro. Clinical implant dentistry and related research. , (2014).
- Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study. Clinical oral implants research. , (2014).
- Caballé-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Zimmermann, M. Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts). IJOMI accepted. , (2014).
- Fulzele, K. Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling. Blood. 121, 930-939 (2013).
- Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor. Journal of. 11, 1703-1714 (1996).
- Kupcova Skalnikova, ., H, Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome. Biochimie. , (2013).
- Romanello, M. Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment. , (2013).
- Schuldt Filho, ., G, Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-β signaling pathways in mesenchymal cells in vitro. J Cranio Maxill Surg. , (2015).
- Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures). The International journal of periodontics & restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).
- Stoecklin-Wasmer, C. Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review. Journal of dental research. 92, 773-781 (2013).
