Bone mezzo condizionato: Preparazione e Bioassay
Summary
Descriviamo qui come preparare a medio-bone condizionata (BCM) e testare la sua attività in vitro.
Abstract
Innesti ossei autologhi sono ampiamente utilizzati in chirurgia orale e maxillofacciale, ortopedia, traumatologia e. Innesti ossei autologhi non solo sostituire l'osso mancante, ma anche sostenere il complesso processo di rigenerazione ossea. Questo comportamento favorevole autoinnesti è attribuita a tre caratteristiche: osteoconduttività, osteogenicity e osteoinduttività. Tuttavia, c'è un altro aspetto: Bone Innesti rilasciare una miriade di molecole, tra cui i fattori di crescita, che può indirizzare le cellule mesenchimali coinvolte nella rigenerazione ossea. Le proprietà paracrini di innesti ossei possono essere studiati in vitro con l'uso del mezzo-bone condizionata (BCM). Qui vi presentiamo un protocollo su come preparare medie osso condizionata da nativo corticale maiale osso, e l'osso che ha subito trattamenti termici o demineralizzazione. Le celle possono essere direttamente esposti alla BCM o seminate su biomateriali, come membrane di collagene, precedentemente ammollati con BCM. Noi diamo esempi in vitro bioassays con cellule mesenchimali sull'espressione di TGF-β geni regolati. I protocolli presentati dovrebbero incoraggiare a rivelare ulteriormente gli effetti paracrini di innesti ossei durante la rigenerazione ossea e aprire un percorso per la ricerca traslazionale nel vasto campo della chirurgia ricostruttiva.
Introduction
Osso autologo è ampiamente utilizzato per colmare difetti che si sono verificati in conseguenza di malformazioni, resezione chirurgica, chirurgia ricostruttiva trauma, e prima dell'impianto posizionamento 1,2. Comprendere i principi biologici di come innesti ossei sostenere il processo di consolidamento del trapianto non è solo la chiave per capire il motivo per cui autologhi sono considerati il gold standard in chirurgia ricostruttiva, è anche bionico per la migliore progettazione di sostituti ossei 3. Eppure, il consolidamento del trapianto è più veloce con osso autologo rispetto alle sostituti ossei 4,5. Pertanto, è imperativo rivelare i meccanismi cellulari e molecolari che rendono osso autologo in modo efficace per sostenere la rigenerazione ossea.
Tre sono le caratteristiche da manuale di autoinnesti che sono considerati a sostenere il processo di consolidamento 6,7. In primo luogo, osso autologo è osteoconduttivo, fornendo una guida per l'osso neoformato di crescerenel difetto. In secondo luogo, osso autologo è osteogenico, il che significa che contiene cellule mesenchimali che possono differenziarsi in osteoblasti 8. In terzo luogo, osso autologo è osteoinduttiva come fattori di crescita come le proteine morfogenetiche ossee sepolti nella matrice possono avviare il processo di endocondrale o addirittura la formazione di osso intramembranosa 9. C'è un altro aspetto: frammenti ossei preparati al momento in possesso di una funzione paracrina sulla base delle osservazioni in vitro con "medio-bone condizionata" 10-15. Inoltre l'impatto di mielopoiesi va detto 16. Un termine simile "medio-matrice ossea demineralizzata condizionata" è già coniato nel 1996 e sostiene il concetto generale di una funzione paracrina di osso, anche se elaborati da demineralizzazione 17. Per i nostri scopi, BCM può essere preparato da maiale fresca mandibole 10,11. Analisi proteomica di BCM ha rivelato la composizione complessa, tra cui effetti di crescitaors e componenti della matrice extracellulare 10, estendendo anche la conoscenza esistente sulla proteasoma di osso intero 18,19. Così, BCM dovrebbe riflettere l'attività rilasciata di varie modifiche di innesti ossei in vitro.
Cosa accade quando le cellule mesenchimali, per esempio quelli isolati da frammenti ossei o da tessuto molle orale, sono esposti a BCM? In vitro, BCM riduce osteogenico e differenziazione adipogenico, e provoca un forte aumento di espressione IL11 11. Genomica microarray rivelato più geni da esprimere differenziale in cellule mesenchimali in risposta a BCM. Tra questi geni sono adrenomedullin (ADM), IL11, IL33, NADPH ossidasi 4 (NOX4), proteoglicani 4 (PRG4, o lubricin) e pentraxina 3 (PTX3) 15. BCM ottenuto da frammenti ossei autoclave riuscito a cambiare l'espressione dei rispettivi geni 14. BCM da frammenti ossei sottoposti a pastorizzazione e di congelamento è stato in grado dimodificare l'espressione genica 14. Mezzo anche condizionata di matrice ossea demineralizzata (DBM-CM) cambia l'espressione di TGF-β-regolati geni 20. È interessante notare che, membrane barriera di collagene usato per schermare i frammenti ossei dal tessuto molle circostante 21,22, assorbiti dalle parti del BCM che sono responsabili per i cambiamenti nell'espressione genica 23. Ricerca BCM può essere estesa ad altri tipi di cellule coinvolte nella rigenerazione ossea come osteoclasti riassorbono l'osso e le cellule endoteliali, per citarne alcuni. Nel complesso, i dati di accumulo in vitro forniscono la base scientifica per la progettazione di uno studio preclinico.
Il presente protocollo è duplice: in primo luogo, si mostra come preparare BCM. In secondo luogo, mostra come testare la sua attività biologica a base di cellule mesenchimali in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Medio-Bone condizionata riflette l'attività rilasciata di innesti ossei durante le prime fasi di rigenerazione ossea. Il protocollo qui descritto può essere adattato per studiare la risposta di diversi tipi di cellule coinvolte nella rigenerazione ossea. Inoltre, il protocollo può essere utilizzato per preparare medium condizionato da riempitivi osso o osso trasformati. I metodi sono facili da eseguire e si basano su un concetto semplice: i fattori rilasciati da varie all'osso autologo ed elaborati. Capire co…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Catherine Solioz for her skillful assistance.
Materials
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
References
- Buser, D. Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation. Journal of dental research. , (2013).
- Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M. augmentation procedures in implant dentistry. The International journal of oral & maxillofacial implants. 24 Suppl. , 237-259 (2009).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E. substitutes: an update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27. , (2005).
- Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).
- Jensen, S. S. Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).
- Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).
- Khan, S. N. The biology of bone grafting. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 13, 77-86 (2005).
- Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery. British. 50, 866-873 (1968).
- Bone Urist, M. R. formation by autoinduction. Science. 150, 893-899 (1965).
- Caballé-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium. The International journal of oral & maxillofacial implants. , (2014).
- Peng, J. Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro. Clinical implant dentistry and related research. , (2014).
- Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study. Clinical oral implants research. , (2014).
- Caballé-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Zimmermann, M. Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts). IJOMI accepted. , (2014).
- Fulzele, K. Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling. Blood. 121, 930-939 (2013).
- Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor. Journal of. 11, 1703-1714 (1996).
- Kupcova Skalnikova, ., H, Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome. Biochimie. , (2013).
- Romanello, M. Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment. , (2013).
- Schuldt Filho, ., G, Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-β signaling pathways in mesenchymal cells in vitro. J Cranio Maxill Surg. , (2015).
- Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures). The International journal of periodontics & restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).
- Stoecklin-Wasmer, C. Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review. Journal of dental research. 92, 773-781 (2013).
