Vi beskriver her hvordan du kan forberede bein kondisjonerte medium (BCM) og teste sin aktivitet in vitro.
Autologe bein grafts er mye brukt i muntlig og maxillofacial kirurgi, ortopedi og traumatologi. Autologe bein grafts ikke bare erstatte manglende bein, de støtter også den komplekse prosessen med bein regenerasjon. Denne gunstige oppførselen autografts er knyttet til de tre kjennetegn: osteoconductivity, osteogenicity, og osteoinductivity. Det er imidlertid et annet aspekt: benimplantater frigi en myriade av molekyler, inkludert vekstfaktorer, som kan målrette mesenchymale celler involvert i benregenerering. De parakrine egenskaper av benimplantater kan studeres in vitro ved anvendelse av ben-kondisjonert medium (BCM). Her presenterer vi en protokoll om hvordan å forberede bein kondisjonerte medium fra mors gris corticalbenet, og bein som gjennomgikk termisk prosessering eller demineralization. Celler kan bli direkte utsatt for BCM eller sådd ut på biomaterialer, såsom kollagen membraner, som tidligere fuktet med BCM. Vi gir eksempler for in vitro bioassays med mesenchymale celler for ekspresjon av TGF-β regulerte gener. De presenterte protokoller bør oppmuntre til videre avsløre parakrine virkningene av bein grafts under benregenerering og åpne en bane for translasjonell forskning i det brede feltet av rekonstruktiv kirurgi.
Autologt ben er mye brukt til å bygge bro feil som oppstod som følge av misdannelse, resective kirurgi, rekonstruktiv traume kirurgi, og før implantatet 1,2. Å forstå de biologiske prinsippene for hvordan benimplantater støtte prosessen av graft konsolidering er ikke bare nøkkelen til å forstå hvorfor autografts anses å være gullstandarden i rekonstruktiv kirurgi, er det også bionic den forbedrede utforming av bein substitutter 3. Likevel er pode konsolidering raskere med autolog bein i forhold til bein erstatter 4,5. Således er det viktig å avdekke de molekylære og cellulære mekanismer som gjør autologt ben så effektive for å støtte benregenerering.
Det er tre lærebok kjennetegn ved autografts som anses for å støtte den konsolideringsprosessen 6,7. Først autolog bein er osteoconductive, og gir veiledning for den nydannede benet til å vokseinn i defekten. Dernest er autolog bein osteogent, noe som betyr at den inneholder mesenchymale celler som kan differensiere til osteoblaster 8. Tredje, autolog bein er osteoinduktivt som vekstfaktorer som benmorfogene proteiner entombed i matrisen kan starte prosessen med endochondral eller intramembranøse beindannelse 9. Det er et annet aspekt: nylagde bein chips holde en parakrine funksjon basert på in vitro observasjoner med "bein kondisjonerte medium" 10-15. Også virkningen av myelopoiesis bør nevnes 16. En tilsvarende begrepet "demineralisert benmatrise kondisjonerte medium" var allerede skapt i 1996 og støtter den generelle begrepet en parakrine funksjon av bein, selv når behandles av demineralization 17. For vårt formål, kan BCM fremstilles av fersk gris underkjever 10,11. Proteomic analyser av BCM avslørte den komplekse sammensetning, inkludert vekst faktumORS og bestanddeler av den ekstracellulære matrise 10, også utvide eksisterende kunnskap på proteasome av hele bein 18,19. Således bør BCM reflektere den frigitte aktivitet av forskjellige modifikasjoner av benimplantater in vitro.
Hva skjer når mesenchymalceller, for eksempel de isolert fra bein chips eller fra oral bløtvev, er utsatt til BCM? In vitro, reduserer BCM osteogen og adipogenic differensiering, og provoserer en sterk økning av IL11 uttrykk 11. Genome bred microarray avslørte flere gener som skal uttrykkes differensielt i mesenchymale celler i respons til BCM. Blant disse genene er adrenomedullin (ADM), IL11, IL33, NADPH oksidase 4 (NOX4), proteoglycan 4 (PRG4, eller lubricin) og pentraxin 3 (PTX3) 15. BCM hentet fra autoklaverte bein chips mislyktes i å endre uttrykket av de respektive genene 14. BCM fra bein chips som gjennomgikk pasteurisering og frysing var i stand til åendre genuttrykk 14. Også kondisjonert medium demineralisert benmatriks (DBM-CM) endrer ekspresjonen av TGF-β-regulerte gener 20. Interessant, kollagen sperre som brukes til å skjerme bein chips fra omkringliggende bløtvev 21,22, adsorbert de deler av BCM som er ansvarlig for endringer i genuttrykk 23. BCM forskning kan utvides til andre celletyper som er involvert i benregenerering som ben-resorberende osteoklaster og endotelceller, for å nevne noen. Totalt sett samler in vitro data gir det vitenskapelige grunnlaget for utformingen av en preklinisk studie.
Denne protokoll er todelt: For det første viser det hvordan å forberede BCM. For det andre viser hvordan du kan teste sin biologiske aktivitet basert på mesenchymale celler in vitro.
Bone kondisjonerte medium reflekterer utgitt aktivitet av bein grafts i den tidlige fasen av bein regenerasjon. Protokollen er beskrevet her kan tilpasses for å studere responsen av forskjellige typer celler som er involvert i benregenerering. Videre kan protokollen anvendes til fremstilling av kondisjonert medium fra bearbeidet bein eller ben fyllstoffer. Metodene er enkle å utføre og stole på et enkelt konsept: de faktorene som frigjøres fra ulike innfødte og bearbeidet bein. Forstå hvordan BCM påvirker mesenc…
The authors have nothing to disclose.
Authors would like to thank Catherine Solioz for her skillful assistance.
Pig Mandibles | Local bucher | ||
Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
Primers | Microsynth | ||
SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
PBS | Roche | 11666789001 |