Bone medium: Förberedelse och bioanalys
Summary
Vi beskriver här hur man förbereder ben konditionerat medium (BCM) och testa dess aktivitet in vitro.
Abstract
Autolog bentransplantat används ofta i muntlig och käkkirurgi, ortopedi och traumatologi. Autolog bentransplantat inte bara ersätta saknade ben, de stöder också den komplexa processen för benuppbyggnad. Denna positiva beteendet hos autotillskrivs de tre egenskaper: osteokonduktivitet, osteogenicity och osteoinduktivitet. Det finns emellertid en annan aspekt: bone grafts släppa en myriad av molekyler, inklusive tillväxtfaktorer, vilka kan rikta mesenkymala celler som är involverade i benåterbildning. De parakrina egenskaper bentransplantat kan studeras in vitro genom användning av ben-konditionerat medium (BCM). Här presenterar vi ett protokoll om hur man förbereder ben konditionerat medium från inhemska gris kortikalt ben och ben som genomgick värmebehandling eller demineralisering. Celler kan direkt utsättas för BCM eller ympas på biomaterial, såsom kollagenmembran, tidigare indränkt med BCM. Vi ger exempel på in vitro bioassays med mesenkymala celler på uttrycket av TGF-β-reglerade gener. De presenterade protokoll bör uppmuntra till ytterligare avslöja parakrina effekterna av bentransplantat under benuppbyggnad och öppna en väg för translationell forskning inom det breda området rekonstruktiv kirurgi.
Introduction
Autolog ben används ofta för att överbrygga brister som uppstått till följd av missbildning, resektiv kirurgi, rekonstruktiv traumakirurgi, och innan implantatet 1,2. Förstå de biologiska principerna för hur benimplantat stödja konsolideringsprocessen transplantat är inte bara nyckeln till att förstå varför auto anses vara guldmyntfoten i rekonstruktiv kirurgi, är det också bionic för förbättrad utformning av bensubstitut 3. Ändå är konsolidering transplantat snabbare med autolog ben jämfört med ben ersätter 4,5. Sålunda är det absolut nödvändigt att avslöja de molekylära och cellulära mekanismer som gör autologt ben så effektiv för att stödja benregenerering.
Det finns tre lärobok egenskaper hos auto som anses stödja konsolideringsprocessen 6,7. Först autolog ben är osteokonduktivt, ge vägledning för det nybildade benet att växai defekten. För det andra är autologt ben osteogen, vilket betyder att det innehåller mesenkymala celler som kan differentiera till osteoblaster 8. Tredje, autolog ben är osteoinduktiv som tillväxtfaktorer som benmorfogenetiska proteiner entombed i matrisen kan inleda processen av endokondral eller ens intramembranös benbildning 9. Det finns en annan aspekt: nylagade benbitar hålla en parakrin funktion baserad på observationer in vitro med "ben konditionerat medium" 10-15. Även effekterna av myelopoes bör nämnas 16. En liknande termen "demineraliserat benmatris-konditionerat medium" var redan myntades 1996 och stöder det övergripande konceptet av en parakrin funktion av ben, även när de behandlas av demineralisering 17. För våra syften, kan BCM framställas av färsk svin mandibles 10,11. Proteomik analyser av BCM avslöjade komplex sammansättning, inklusive tillväxt faktumyttersta randområdena och beståndsdelar i den extracellulära matrisen 10, som sträcker sig även befintlig kunskap om proteasomet av hela ben 18,19. Sålunda bör BCM spegla den frisatta aktiviteten av olika modifikationer av bentransplantat in vitro.
Vad händer när mesenkymala celler, till exempel sådana som isolerats från benbitar eller från oral mjukvävnad, utsätts för BCM? In vitro minskar BCM osteogen och adipogena differentiering, och framkallar en kraftig ökning av IL11 uttryck 11. Genome breda mikromatris avslöjade flera gener som skall differentiellt uttryckt i mesenkymala celler som svar på BCM. Bland dessa gener är adrenomeduUin (ADM), IL11, IL33, NADPH-oxidas 4 (NOX4), proteoglykan 4 (PRG4 eller lubricin) och pentraxin 3 (PTX3) 15. BCM erhållits från autoklave benbitar inte ändra uttrycket av respektive gener 14. BCM från benbitar som genomgick pastörisering och frysning kundeändra genexpression 14. Också konditionerat medium av demineraliserat benmatris (DBM-CM) ändrar expressionen av TGF-β-reglerade gener 20. Intressant, kollagenbarriärmembran som används för att skydda de benbitar från den omgivande mjuka vävnaden 21,22, adsorberat de delar av BCM som är ansvariga för de förändringar i genuttryck 23. BCM forskning kan utvidgas till andra celltyper som är involverade i benuppbyggnad såsom benresorberande osteoklaster och endotelceller, för att nämna några. Sammantaget ackumulerande in vitro-data ger en vetenskaplig grund för utformningen av en preklinisk studie.
Den nuvarande protokollet är tvåfaldigt: För det första visar det hur man förbereder BCM. För det andra visar det hur man testar sin biologiska aktivitet baserad på mesenkymala celler in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bone-konditionerat medium speglar släppt aktivitet bentransplantat under de tidiga stadierna av benuppbyggnad. Protokollet som beskrivs här kan anpassas för att studera svaret hos olika typer av celler som är involverade i benåterbildning. Vidare kan protokollet användas för att framställa konditionerat medium från bearbetade ben- eller skelettfyllmedel. Metoderna är lätta att utföra och förlita sig på ett enkelt koncept: de faktorer som frigörs från olika inhemska och bearbetat ben. Att förstå hur BCM…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Catherine Solioz for her skillful assistance.
Materials
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
References
- Buser, D. Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation. Journal of dental research. , (2013).
- Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M. augmentation procedures in implant dentistry. The International journal of oral & maxillofacial implants. 24 Suppl. , 237-259 (2009).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E. substitutes: an update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27. , (2005).
- Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).
- Jensen, S. S. Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).
- Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).
- Khan, S. N. The biology of bone grafting. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 13, 77-86 (2005).
- Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery. British. 50, 866-873 (1968).
- Bone Urist, M. R. formation by autoinduction. Science. 150, 893-899 (1965).
- Caballé-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium. The International journal of oral & maxillofacial implants. , (2014).
- Peng, J. Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro. Clinical implant dentistry and related research. , (2014).
- Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study. Clinical oral implants research. , (2014).
- Caballé-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Zimmermann, M. Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts). IJOMI accepted. , (2014).
- Fulzele, K. Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling. Blood. 121, 930-939 (2013).
- Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor. Journal of. 11, 1703-1714 (1996).
- Kupcova Skalnikova, ., H, Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome. Biochimie. , (2013).
- Romanello, M. Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment. , (2013).
- Schuldt Filho, ., G, Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-β signaling pathways in mesenchymal cells in vitro. J Cranio Maxill Surg. , (2015).
- Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures). The International journal of periodontics & restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).
- Stoecklin-Wasmer, C. Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review. Journal of dental research. 92, 773-781 (2013).
