Os milieu conditionné: Préparation et essais biologiques
Summary
Nous décrivons ici comment préparer milieu de l'os de la climatisation (BCM) et de tester son activité in vitro.
Abstract
Greffes osseuses autologues sont largement utilisés dans la chirurgie orale et maxillo-faciale, orthopédie, traumatologie et. Greffes osseuses autologues ne remplacent pas seulement os manquant, ils soutiennent également le processus complexe de la régénération osseuse. Ce comportement favorable des autogreffes est attribuée aux trois caractéristiques: ostéoconductivité, osteogenicity et ostéoinductivité. Cependant, il est un autre aspect: Greffons osseux libérer une multitude de molécules, y compris les facteurs de croissance, qui peuvent cibler des cellules mésenchymateuses impliquées dans la régénération osseuse. Les propriétés paracrines des greffes osseuses peuvent être étudiés in vitro par l'utilisation du support d'os conditionné (BCM). Ici, nous présentons un protocole sur la façon de préparer le milieu de l'os cortical conditionné à partir natif de porc os et l'os qui a subi un traitement thermique ou déminéralisation. Les cellules peuvent être directement exposés à la BCM ou ensemencées sur les biomatériaux, tels que les membranes de collagène, préalablement trempées avec BCM. Nous donnons des exemples pour in vitro bioassays avec des cellules mésenchymateuses sur l'expression des gènes régulés par le TGF-β. Les protocoles présentés devraient inciter à révéler davantage les effets paracrines de greffes osseuses pendant la régénération osseuse et ouvrir un chemin pour la recherche translationnelle dans le vaste domaine de la chirurgie reconstructive.
Introduction
Osseuse autologue est largement utilisé pour combler les défauts qui ont eu lieu à la suite d'une malformation, une chirurgie d'exérèse, la chirurgie traumatologique reconstructive, et avant le placement de l'implant 1,2. Comprendre les principes biologiques de la façon dont les greffons osseux soutenir le processus de consolidation de la greffe est non seulement la clé pour comprendre pourquoi autogreffes sont considérés comme l'étalon-or en chirurgie reconstructive, il est également bionique pour améliorer la conception des substituts osseux 3. Pourtant, la consolidation de la greffe est plus rapide avec de l'os autologue par rapport à 4,5 substituts osseux. Ainsi, il est impératif de révéler les mécanismes moléculaires et cellulaires qui font osseuse autologue si efficace pour soutenir la régénération osseuse.
Il ya trois caractéristiques de manuels de autogreffes qui sont considérés pour soutenir le 6,7 de processus de consolidation. Tout d'abord, l'os autologue est ostéoconducteur, fournissant des orientations pour l'os nouvellement formé à croîtredans le défaut. Deuxièmement, l'os autologue est ostéogénique, ce qui signifie qu'il contient des cellules mésenchymateuses qui peuvent se différencier en ostéoblastes 8. Troisièmement, l'os autologue est ostéoinductrice comme des facteurs de croissance comme les protéines morphogénétiques osseuses ensevelis dans la matrice peuvent initier le processus de endochondral ou même intramembranaire formation osseuse 9. Il ya un autre aspect: éclats d'os fraîchement préparés détiennent une fonction paracrine sur la base des observations in vitro avec «milieu de l'os-conditionné" 10-15. De plus l'impact de la myélopoïèse 16 convient de mentionner. Un terme similaire "milieu de la matrice osseuse déminéralisée conditionné" a déjà été inventé en 1996 et soutient le concept global d'une fonction paracrine de l'os, même lorsque traité par déminéralisation 17. Pour nos fins, BCM peut être préparé à partir de porc fraîche mandibules 10,11. Analyses protéomiques de BCM a révélé la composition complexe, y compris effet de la croissanceors et constituants de la matrice extracellulaire 10, étendant également les connaissances actuelles sur le protéasome de l'os ensemble 18,19. Ainsi, BCM devrait refléter l'activité libéré de diverses modifications de greffes osseuses in vitro.
Qu'est-ce qui se passe lorsque les cellules mésenchymateuses, par exemple celles qui sont isolées à partir de fragments d'os ou de tissus mous de la bouche, sont exposés à BCM? In vitro, BCM réduit ostéogénique et la différenciation adipocytaire, et provoque une forte augmentation de l'expression de 11 IL11. Génome large microréseau a révélé plusieurs gènes d'être exprimés de manière différentielle dans des cellules mésenchymateuses en réponse à BCM. Parmi ces gènes sont adrénomédulline (ADM), IL11, IL33, la NADPH oxydase 4 (NOX4), des protéoglycanes 4 (PRG4 ou lubricin) et pentraxine 3 (PTX3) 15. BCM obtenu à partir de copeaux d'os autoclave n'a pas réussi à modifier l'expression des gènes respectifs 14. BCM à partir de fragments d'os qui ont subi la pasteurisation et de congélation a pumodifier l'expression des gènes 14. Aussi milieu conditionné de la matrice osseuse déminéralisée (DBM-CM) modifie l'expression du TGF-β gènes régulés 20. Fait intéressant, les membranes de barrière de collagène utilisées pour protéger les copeaux d'os du tissu mou environnant 21,22, adsorbés les parties de BCM qui sont responsables de l'évolution de l'expression du gène 23. la recherche de BCM peut être étendu à d'autres types de cellules impliquées dans la régénération osseuse tels que les ostéoclastes de résorption osseuse et les cellules endothéliales, pour ne nommer que quelques-uns. Globalement, les données d'accumulation in vitro fournissent la base scientifique pour la conception d'une étude préclinique.
Le présent protocole est double: d'abord, il montre comment préparer BCM. Deuxièmement, il montre comment tester son activité biologique à base de cellules mésenchymateuses in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Support d'os conditionné reflète l'activité libéré de greffons osseux au cours des premiers stades de la régénération osseuse. Le protocole décrit ici peut être adapté à étudier la réponse de différents types de cellules impliquées dans la régénération osseuse. En outre, le protocole peut être utilisé pour préparer un milieu conditionné à partir de transformés os ou des charges. Les méthodes sont faciles à réaliser et de compter sur un concept simple: les facteurs libérés à partir …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Catherine Solioz for her skillful assistance.
Materials
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
References
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