赤血球凝集の動的な調査のための制御されたマイクロ流体環境

Summary

プロトコルは、画像処理技術に基づいて、詳細に制御され、一定の剪断速度の下で赤血球（RBC）の凝集体を定量化するための実験手順を記載しています。このプロトコルの目的は、制御されたマイクロ流体環境で対応するせん断速度に赤血球凝集体のサイズを関連付けることです。

Abstract

血液は、非ニュートン生体液として、血液レオロジーの分野における多くの研究の焦点を表します。血液成分は、血漿中に懸濁された赤血球、白血球及び血小板を含みます。によるRBCの存在量（血液量の40％〜45％）に、彼らの行動は、特に微小循環の血液のレオロジー挙動を決定します。非常に低いせん断速度で、RBCが組み立てに見られている、フォームの実体は、血液の非ニュートン挙動を引き起こす、凝集体と呼ばれます。これは、微小循環における血液レオロジーを把握するために、凝集体形成の条件を理解することが重要です。ここで説明するプロトコルは、画像処理に基づいて、一定のせん断速度下で定量的に微小循環におけるRBC凝集体を決定するための実験手順について詳しく説明します。この目的のために、RBC-懸濁液は120×60μmのポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロチャネル中で試験され、分析されます。 RBC-懸濁液は、耳鼻咽喉科であります血液層内の線速度プロファイルを得るので、一定の剪断速度の広い範囲を達成するために、第2の流体を使用して雨が降りました。 RBC凝集は、高速カメラを用いて可視化しながら剪断速度は、マイクロ粒子画像流速（μPIV）システムを使用して決定されます。 RBC凝集体の捕捉されたビデオは、画像強度に基づいて、集合のサイズを決定するために画像処理技術を用いて分析されます。

Introduction

赤血球（RBC）は、血液のレオロジー挙動を決定する上で重要な役割を果たしています。彼らは、ほぼ単独でin vitroおよびin vivoでの血液の特定の性質を担当しています。生理的条件下では、赤血球は、血液量の40％〜45％を占めます。微小循環において、赤血球は、より小さな血管径とプラズマスキミング効果¹の血液量の20％までを占めます。微小循環における血漿低減のこの現象は、フォーレウス効果として知られています。低剪断速度では、赤血球は、したがって、血液の非ニュートン挙動に寄与し、一緒にブリッジと「連銭」または凝集体と呼ばれる一次元又は三次元構造を形成することができます。しかし、RBC凝集のメカニズムは完全に理解されていません。二つの理論は、RBCの凝集をモデル化するために存在する：細胞理論の橋渡しを起因高分子²の架橋及び力attracへ浸透勾配³に起因する分子の枯渇によって引き起こさ化理論。

典型的には、ヒトの血液のために、凝集体は、1〜10秒^-1までの範囲の非常に低いせん断速度⁴で形成されます。この範囲を超えると、RBCが脱凝集し、血管内に別々に流れる傾向にあります。

凝集体形成の条件を理解することは、血液のレオロジー挙動を定義するという点で血液レオロジーの分野に非常に重要です。これらの凝集体は、多くの場合、macrocirculationレベル（> 300μmの直径^）5で見られています。このスケールでは、血液は、ニュートン流体と均一な混合物と見なされます。しかし、これらの凝集体はほとんど毛細管レベル（直径4-10μm）の中に見られないと、通常、糖尿病⁶や肥満などの病的状態の指標です。 RBC凝集を変えることができる他の病的状態は、炎症性または感染状態を含み、高血圧やアテローム性動脈硬化症、遺伝性疾患および慢性疾患⁷などの心血管疾患。したがって、赤血球凝集メカニズムを理解し、（これらの凝集体の大きさや流れの状態との間の関係を定義することによって）、これらのエンティティを分析して、血液のmicrorheological行動の理解につながるので、臨床応用にそれを関連付けることができます。

RBC凝集物は、ヘマトクリット値（血液中の赤血球の体積）、剪断速度、血管径、RBC膜の剛性および懸濁培地組成^8-10のようないくつかの要因によって変更することができます。したがって、制御された条件は、効果的にRBC凝集体を分析するために必要とされます。いくつかの方法は、血液の動作に関連する情報を提供しています静的アグリゲーション測定（集計インデックス）を提供することにより、凝集体形成を解析することができます。これらの方法は、とりわけ、赤血球沈降速度を含みます方法^11、光透過法^12、光反射法¹³と低剪断粘度法^14。

いくつかの研究は、RBC凝集を研究し、制御された流れ条件^15-17における凝集の程度を決定することを試みました。しかし、これらの研究は、間接的に凝集の程度についての情報だけでなく、地元の粘度を提供する顕微鏡血液画像に基づいて測定された剪断システム内の占有スペースの比率を決定することにより、赤血球凝集体の大きさを調べます。

そこで、直接制御し、一定のせん断速度下で、動的に、RBCは、微小循環に集約定量化するための新しい手順を提示します。 RBC懸濁物は、したがって、血液層にせん断流を作り出すリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液を、（ 図1に示されるように）二重Y字型マイクロチャネルに、同伴されます。この血液層定数シア以内R率を得ることができます。 RBC懸濁物は、異なるヘマトクリット値（H）レベル（5％、10％及び15％）で異なる剪断速度（2-11秒^-1）下で試験されます。血流速度および剪断速度は、フローは、高速カメラを用いて可視化されている間、マイクロ粒子画像流速（μPIV）システムを使用して決定されます。得られた結果は、赤血球を検出し、凝集体のサイズを決定するために、画像強度に基づいて、MATLABコードで処理されます。

Protocol

血液は、オタワ大学（H11-13-06）の倫理委員会の承認を得て、健康な個体から収集されます。 1.マイクロチャネルの作製マイクロチャネルは、標準的なフォトリソグラフィ法18に基づいて製造されています。 コンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアを使用して、マイクロチャネルの幾何学的形状を設計し、透明性のフォトマスクの設?…

Representative Results

ヒトの赤血球が5％、10％、15％ヘマトクリットで懸濁し、10μL/ hrで流れるために二重Y-マイクロチャネル内の2つの流体の流れの例を図2に示されている。 図3は、時集合サイズの差を示していますチャネル内の流れは、10％のヘマトクリット5μL/時間に10μL/時から減少されます。ヘマトクリットおよびせん断速度を変化させたときに凝集体の大きさの定性的な概念を与え…

Discussion

本発明の方法論を使用して、異なる流れ条件及びヘマトクリット下定性的および定量RBC凝集体を分析することが可能です。成功したテストと集計検出のためには、マイクロチャネルの入口に二つの流体の間の適切な速度比を決定するために重要です。この比は、速度プロファイル¹⁹準線形である最適な血液層の厚さを得ることは非常に重要です。

成功したテスト?…

Materials

SU8-50 epoxy based negative Photo-resist	MicroChem Corp.
SU8-50 developer	MicroChem Corp.
Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184	Dow-Corning	3097358-1004
PE-50 series Plasma system	Plasma Etch	PE-50 series
Blood collection tubes with K2 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	FisherSci	B367861
Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2	Thermo Scientific	004260F
Poshpate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Tracer fluorescent particles solution (15 mL)	FisherSci	R800
Aggregometer	RheoMeditech	Rheo Scan AnD300
Glass syringes (50 µL)	Hamilton	80965
Tubing (Tygon)	FisherSci	AAA00001
High speed camera (Basler)	Graftek Imaging Inc.	basler acA2000-340km	A camera capable of recording 18 frames per seconds could be used.
Double pulsed camera	LaVision	Imager Intense
Microscope MITAS	LaVision	MITAS
Nd:YAG laser	New Wave Research	Solo-II
Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus)	Chemyx Inc. and Harvard Apparatus	Nexus3000 and PicoPlus
DaVis software	LaVision	Davis