Controlled Environment Mikrofluidik für dynamische Untersuchung der Aggregation roter Blutzellen
Summary
Das Protokoll beschriebenen Einzelheiten ein experimentelles Verfahren, um rote Blutzellen (RBC) Aggregate unter einer kontrollierten und konstanten Scherrate zu quantifizieren, auf Basis von Bildverarbeitungstechniken. Das Ziel des Protokolls ist es, RBC Aggregatgrößen an den entsprechenden Schergeschwindigkeit kontrolliert mikrofluidischen Umwelt beziehen.
Abstract
Blut als nicht-Newtonsche Biofluid, stellt die Gegenstand zahlreicher Studien im Hämorheologie Feldes. Blutbestandteile sind rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen und Blutplättchen, die im Blutplasma suspendiert sind. Aufgrund der Fülle der RBCs (40% bis 45% des Blutvolumens) diktiert ihr Verhalten, das rheologische Verhalten von Blut besonders in der Mikrozirkulation. Bei sehr niedrigen Scherraten werden RBCs gesehen zu montieren und Form Entitäten, die als Aggregate, die das nicht-Newtonsche Verhalten von Blut bewirkt. Es ist wichtig, die Bedingungen der Granulatbildung zu verstehen, um die Rheologie des Blutes in die Mikrozirkulation zu verstehen. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die experimentelle Vorgehensweise, um die RBC-Aggregate in der Mikrozirkulation unter konstanten Scherrate quantitativ zu bestimmen, basierend auf Bildverarbeitung. Zu diesem Zweck werden RBC-Suspensionen geprüft und 120 x 60 & mgr; m Poly-Dimethyl-Siloxan (PDMS) Mikrokanäle analysiert. Die RBC-Suspensionen sind entregnete es mit einem zweiten Fluid, um eine lineare Geschwindigkeitsprofil innerhalb des Blutschicht zu erhalten und somit eine Vielzahl von konstanten Scherraten. Die Schergeschwindigkeit ist mit einem Mikro Particle Image Velocimetry (μPIV) Systems bestimmt, während RBC Aggregate werden mit einer Hochgeschwindigkeitskamera sichtbar gemacht. Die der RBC Aggregate aufgenommenen Videos unter Verwendung von Bildverarbeitungstechniken, um die Aggregatgrößen basierend auf den Bildern Intensitäten zu bestimmen.
Introduction
Rote Blutkörperchen (Erythrozyten) spielen eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung des rheologischen Verhaltens von Blut. Sie sind fast einzigartig für die besonderen Eigenschaften von Blut in vitro und in vivo verantwortlich ist. Unter physiologischen Bedingungen RBCs besetzen 40% bis 45% des Blutvolumens. Der Mikrozirkulation, RBCs nur besetzen bis zu 20% des Blutvolumens durch kleinere Gefäßdurchmesser und dem Plasma skimming effect 1. Dieses Phänomen der Plasmareduktion in der Mikrozirkulation als Fahraeus Wirkung bekannt. Bei niedrigen Schergeschwindigkeiten sind RBCs in der Lage über die Bridge und bilden eine oder dreidimensionale Strukturen genannt "Geldrollen" oder Aggregaten, die damit verbundenen Auswirkungen auf die nicht-Newtonsche Verhalten von Blut. Jedoch ist der Mechanismus der RBC Aggregation nicht vollständig verstanden. Zwei Theorien existieren, um die Aggregation von Erythrozyten zu modellieren: die Überbrückung von Zellen Theorie aufgrund der Quervernetzung der Makromoleküle 2 und dem Kraft attraktion Theorie durch Verarmung der Moleküle aufgrund der osmotischen Gradienten 3 verursacht.
Typischerweise ist für menschliches Blut, Aggregate bilden bei sehr niedrigen Scherraten 4 im Bereich von 1 bis 10 s -1 aufweist. Oberhalb dieses Bereichs neigen Erythrozyten zu zerlegen und separat zu fließen innerhalb des Gefäßes.
Das Verständnis der Bedingungen der Aggregate Bildung eines großen Wert auf die Hämorheologie Bereich in Bezug auf die Definition rheologische Verhalten Blut. Diese Aggregate werden oft an der Makrozirkulation Niveau (> 300 & mgr; m Durchmesser) 5 zu sehen. An diesem Maßstab wird Blut als Newtonsche Flüssigkeit und einer homogenen Mischung berücksichtigt. Jedoch werden diese Aggregate seltener im Kapillarebene (4-10 & mgr; m im Durchmesser) zu sehen sind und in der Regel ein Hinweis auf pathologische Zustände wie Diabetes 6 und Fettleibigkeit. Andere pathologische Zustände, die verändern könnten RBC Aggregation gehören entzündlich oder infektiös Bedingungenkardiovaskuläre Erkrankungen wie Bluthochdruck oder Arteriosklerose, genetischen Erkrankungen und chronische Erkrankungen 7. Daher steht die RBC Aggregationsmechanismus und Analysieren dieser Entitäten (durch Definition einer Beziehung zwischen der Größe dieser Aggregate und der Strömungsverhältnisse) könnte zum Verständnis der microrheological Verhalten von Blut führen und somit in Beziehung zu klinischen Anwendungen.
RBC Aggregate kann durch verschiedene Faktoren wie der Hämatokrit (Volumen von RBCs in Blut), der Scherrate, des Gefäßdurchmessers, der RBC-Membransteifigkeit und dem Suspendiermedium Zusammensetzung 8-10 verändert werden. Daher werden kontrollierten Bedingungen, um die RBC-Aggregate effektiv zu analysieren erforderlich. Mehrere Verfahren sind in der Lage, die Aggregatbildung durch statische Messungen Aggregation (Aggregationsindex) zu analysieren, die relevanten Informationen über Blut Verhalten bietet. Diese Verfahren umfassen unter anderem die BlutsenkungsgeschwindigkeitVerfahren 11, die Lichtübertragungsverfahren 12, die Lichtreflexionsverfahren 13 und die niedrige Scherviskosität Verfahren 14.
Einige Studien haben versucht, RBC Aggregation untersuchen und bestimmen den Grad der Aggregation in kontrollierten Strömungsverhältnissen 15-17. Allerdings sind diese Studien indirekt untersuchen RBC Aggregatgrößen durch Bestimmen des Verhältnisses der belegten Raum in einem Schersystem gemessen basierend auf mikroskopische Blutbilder die Informationen über den Grad der Aggregation als auch der lokalen Viskosität.
Wir stellen daher ein neues Verfahren, um direkt zu quantifizieren RBC-Aggregate in der Mikrozirkulation, dynamisch, unter kontrollierten und konstanten Scherraten. RBC-Suspensionen werden mitgerissen, in einem doppelten Y-Mikrokanal (wie in Figur 1 dargestellt), mit einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) somit die Schaffung einer Scherströmung in der Blutschicht. Innerhalb dieser Blutschicht eine konstante Shear Rate erhalten werden kann. Die RBC-Suspensionen bei verschiedenen Hämatokrit (H) Ebenen (5%, 10% und 15%) und unter verschiedenen Scherraten (2-11 sec -1) getestet. Die Blutgeschwindigkeit und Schergeschwindigkeit werden mit einem Mikro Particle Image Velocimetry (μPIV) System, während die Strömung visualisiert mit einer Hochgeschwindigkeitskamera bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse werden dann mit einem MATLAB-Code basierend auf den Bildintensitäten, um die RBCs erfassen und Aggregatgrößen verarbeitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unter Verwendung der vorliegenden Methode ist es möglich, qualitativ und quantitativ analysiert die RBC-Aggregate unter verschiedenen Strömungsbedingungen und Hämatokritwerten. Für die erfolgreiche Prüfung und Aggregat Detektion ist es von entscheidender Bedeutung, um den entsprechenden Geschwindigkeitsverhältnis zwischen den beiden Fluiden an der Mikrokanaleintrag zu bestimmen. Dieses Verhältnis ist sehr wichtig, um eine optimale Blutschichtdicke, wo das Geschwindigkeitsprofil quasi lineare 19 erhalte…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada unterstützt. Mikrofabrikation wurde mit Unterstützung der McGill Nanotools Microfab Anlage an der McGill Universität und der Abteilung für Elektronik an der Carleton University durchgeführt.
Materials
| SU8-50 epoxy based negative Photo-resist | MicroChem Corp. | ||
| SU8-50 developer | MicroChem Corp. | ||
| Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184 | Dow-Corning | 3097358-1004 | |
| PE-50 series Plasma system | Plasma Etch | PE-50 series | |
| Blood collection tubes with K2 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | FisherSci | B367861 | |
| Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 | Thermo Scientific | 004260F | |
| Poshpate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Tracer fluorescent particles solution (15 mL) | FisherSci | R800 | |
| Aggregometer | RheoMeditech | Rheo Scan AnD300 | |
| Glass syringes (50 µL) | Hamilton | 80965 | |
| Tubing (Tygon) | FisherSci | AAA00001 | |
| High speed camera (Basler) | Graftek Imaging Inc. | basler acA2000-340km | A camera capable of recording 18 frames per seconds could be used. |
| Double pulsed camera | LaVision | Imager Intense | |
| Microscope MITAS | LaVision | MITAS | |
| Nd:YAG laser | New Wave Research | Solo-II | |
| Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus) | Chemyx Inc. and Harvard Apparatus | Nexus3000 and PicoPlus | |
| DaVis software | LaVision | Davis |
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