微流控控制环境的红细胞聚集动态调查

Summary

该协议描述细节的实验步骤，根据一个控制的和恒定的剪切速率量化红血细胞（RBC）的聚集体的基础上，图像处理技术。这个协议的目标是涉及红细胞聚集体尺寸，以在受控的微流体环境中的相应的剪切速率。

Abstract

血液，作为一个非牛顿生物流体，表示了大量的研究，在血液流变学领域的焦点。血液成分包括红血细胞，白血细胞和血小板是悬浮在血浆中。由于红细胞​​的丰度（40％至45％的血液量），它们的行为决定尤其在微循环的血液的流变行为。在非常低的剪切速率下，红细胞被视为组装和形式的实体称为聚集体，这会导致血液的非牛顿行为。重要的是要了解的聚集体形成的条件领悟血液流变学微循环是很重要的。这里描述的协议详细的实验程序来确定定量的红细胞聚集体在微循环在恒定剪切速率，基于图像处理。为了这个目的，红细胞悬浮液测试，并在120×60微米的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道进行分析。该红细胞悬浮液耳鼻喉科下雨，以获得血液层内的线速度信息，从而实现了广泛的恒定剪切速率下使用的第二流体。剪切速率是使用微粒子图像测速（μPIV）系统测定，而红细胞聚集体使用高速照相机可视化。捕获的红细胞聚集的视频使用图像处理技术，以确定基于所述图像强度的聚集体尺寸进行分析。

Introduction

红血细胞（红细胞）在决定血液的流变行为了至关重要的作用。它们几乎单独地负责的血液在体外和体内的特定性质。在生理条件下，红细胞占40％至45％的血液量。在微循环，红细胞仅占到血量的20％，由于更小的血管直径和等离子体掠过效果^1。这种现象在微等离子体还原的被称为Fåhræus效果。在低剪切速率，红细胞能够桥接在一起，形成一维或三个所谓“红细胞钱串”或聚集维结构，从而有助于血液的非牛顿行为。然而，红细胞聚集的机制尚未完全了解。两种理论存在红细胞的聚集模型：细胞理论的桥接由于交联的大分子²和力attrac由于渗透压梯度³所引起的分子的耗尽化的理论。

通常，对于人血，聚集体在非常低的剪切速率⁴从1到10秒^-1形成。高于此范围，红细胞倾向于分解和在容器内分开流动。

了解的聚集形成的条件是一个非常重要的领域血液流变学在确定血液的流变行为的条款。这些聚集经常看到在大循环水平（> 300直径微米^）5。以该刻度，血液被认为是作为牛顿流体和均匀的混合物。然而，这些聚集体很少见到在毛细管水平（4-10微米直径），通常的病理状况如糖尿病⁶和肥胖的指示。等病理状态下可能会改变红细胞聚集包括炎症或感染的条件，心血管疾病如高血压或动脉粥样硬化，遗传性疾病和慢性疾病^7。因此，了解红细胞聚集机制和分析这些实体（通过定义这些聚集和流动条件的大小之间的关系）可能导致血液的微观流变行为的理解，因此涉及到临床应用。

红细胞聚集体可以由几个因素来改变，例如血细胞比容（血液中红细胞的体积），剪切速率，血管直径，红细胞的膜刚度和悬浮介质的组合物^8-10。因此，控制的条件是必需的，以便有效地分析红细胞聚集体。有几种方法可以提供静态汇聚测量（聚集索引）分析聚集形成，提供约血行为的相关信息。这些方法包括，除其他外，血沉法如图¹¹所示，光传输方法¹²中，光反射法¹³和低剪切粘度方法^14。

很少有研究试图研究红细胞聚集，并确定聚集在控制流动条件^15-17度。然而，这些研究间接调查红细胞聚集体尺寸通过确定基于微观血图像提供关于聚集程度以及本地粘度信息测定的剪切系统的占用空间的比率。

因此，我们提出了一个新的程序直接量化红细胞聚集的微循环，动态的，在可控制的恒定剪切速率。红细胞悬液被夹带，在双Y型微通道（ 如图1），与磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的溶液，因此产生在血液层的剪切流动。在这血层恒定乳木果ř速率可以得到。的红细胞悬浮液在不同血细胞比容（H）的水平（5％，10％和15％），并在不同的剪切速率（2-11秒^-1）进行测试。的血流速度和剪切速率使用的微粒子图像测速（μPIV）系统流被使用高速照相机显现而确定的。所得到的结果然后被处理以基于图像强度，以检测RBC和确定聚集体尺寸一个MATLAB代码。

Protocol

血液从健康人与渥太华大学（H11-13-06）的伦理委员会的批准收集。 1.制造微通道微通道是基于标准光刻方法18制造。 设计使用计算机辅助设计（CAD）软件的微通道的几何形状和打印在透明光掩模的配置。这些掩码是至关重要的，因为它们在制造过程中决定了光路。在这种情况下，微通道尺寸是120微米厚，60微米的深度和7毫米的长度。 <…

Representative Results

在双Y型微通道中的双流体流程的例子示于图2人类红细胞悬浮在5％，10％和15％的血细胞比容和流速为10微升/小时。 图3示出了聚集体尺寸时的差在通道中的流动是从10微升/小时降低到5微升/小时的10％的血细胞比容。这使这些聚集体的尺寸的定性概念不同的血细胞比容和剪切速率时， 图5所示的四种人红细胞聚集体的位移，对三个连续帧，从而提供所需的相机?…

Discussion

使用本方法，有可能以定性分析和定量红细胞聚集不同流动条件和血细胞比容下。对于成功的测试和总检测，关键的是要确定在所述微通道入口在两种流体之间的适当速度比。这个比例是非常重要的，以获得最佳的血层厚度，其中的速度分布是准线性^19。

成功测试的另一个关键因素是一个不错的成像质量。实际上，由于该方法是基于图像处理，这是非常重要的是要有?…

Materials

SU8-50 epoxy based negative Photo-resist	MicroChem Corp.
SU8-50 developer	MicroChem Corp.
Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184	Dow-Corning	3097358-1004
PE-50 series Plasma system	Plasma Etch	PE-50 series
Blood collection tubes with K2 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	FisherSci	B367861
Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2	Thermo Scientific	004260F
Poshpate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Tracer fluorescent particles solution (15 mL)	FisherSci	R800
Aggregometer	RheoMeditech	Rheo Scan AnD300
Glass syringes (50 µL)	Hamilton	80965
Tubing (Tygon)	FisherSci	AAA00001
High speed camera (Basler)	Graftek Imaging Inc.	basler acA2000-340km	A camera capable of recording 18 frames per seconds could be used.
Double pulsed camera	LaVision	Imager Intense
Microscope MITAS	LaVision	MITAS
Nd:YAG laser	New Wave Research	Solo-II
Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus)	Chemyx Inc. and Harvard Apparatus	Nexus3000 and PicoPlus
DaVis software	LaVision	Davis