Kontrolleret Mikrofluid Miljø for Dynamic Undersøgelse af røde blodlegemer Sammenlægning
Summary
Protokollen beskrevet nærmere en eksperimentel procedure at kvantificere Red Blood Cell (RBC) aggregater under en styret og konstant forskydningshastighed, baseret på billedbehandlingsteknikker. Målet med denne protokol er at relatere RBC aggregerede størrelser til den tilsvarende forskydningshastighed i et kontrolleret microfluidic miljø.
Abstract
Blod, som en ikke-newtonsk biovæske, repræsenterer fokus for talrige undersøgelser i hemorheology felt. Blodbestanddele omfatter røde blodlegemer, hvide blodlegemer og blodplader, der er suspenderet i blodplasma. På grund af den overflod af de røde blodlegemer (40% til 45% af blodvolumen), deres adfærd dikterer den rheologiske opførsel af blod især i mikrocirkulation. Ved meget lave forskydningshastigheder, der RBC'er ses at samle og danne enheder kaldet aggregater, hvilket forårsager ikke-newtonsk opførsel af blod. Det er vigtigt at forstå betingelserne for aggregater formationen for at forstå blodet rheologien i mikrocirkulationen. Protokollen beskrevet her beskriver den eksperimentelle procedure til kvantitativ bestemmelse af RBC aggregater i mikrocirkulationen under konstant forskydningshastighed, baseret på billedbehandling. Til dette formål er RBC-suspensioner testet og analyseret i 120 x 60 um poly-dimethyl-siloxan (PDMS) mikrokanaler. RBC-suspensioner er entspredes ved hjælp af et andet fluid for at opnå en lineær hastighed profilen blodet lag og dermed opnå en lang række konstante forskydningshastigheder. Den forskydningshastighed bestemmes ved hjælp af et system, micro Particle billede Velocimetri (μPIV), mens RBC aggregater visualiseres ved hjælp af en høj hastighed kamera. Videoerne fanget af RBC aggregater analyseres ved hjælp af billedbehandling teknikker for at bestemme de samlede størrelser baseret på billeder intensiteter.
Introduction
Røde blodlegemer (RBC) spiller en afgørende rolle i fastsættelsen af rheologiske opførsel af blod. De er næsten ualmindeligt ansvarlige for de særlige egenskaber for blod in vitro og in vivo. Under fysiologiske betingelser, RBC'er optager 40% til 45% af blodvolumen. I mikrocirkulationen, kun RBC optager op til 20% af blodvolumen grundet mindre fartøj diametre og plasma skimming virkning 1. Dette fænomen af plasma reduktion i mikrocirkulationen er kendt som Fåhræus virkning. Ved lave forskydningshastigheder, RBC'er er i stand til at bygge bro sammen og danne en dimensional eller tredimensionale strukturer kaldet "rouleaux" eller aggregater, dermed bidrager til den ikke-newtonsk opførsel af blod. Imidlertid er mekanismen af RBC aggregation ikke fuldstændigt forstået. Der findes to teorier at modellere sammenlægning af RBC: at bygge bro over celler teori på grund af den krydsbinding af makromolekyler 2 og force attraksesteori forårsaget af udtømning af molekylerne på grund af den osmotiske gradient 3.
Typisk for humant blod, aggregater dannes ved meget lave forskydningshastigheder 4 i området fra 1 til 10 sek -1. Over dette område, RBC'er tendens til at opsplitte og flow separat inden i karret.
Forståelse betingelserne for aggregater dannelsen er af stor betydning for hemorheology felt i form af at definere blodets reologiske adfærd. Disse aggregater er ofte set på macrocirculation niveau (> 300 um diameter) 5. På denne skala, er blod betragtes som en newtonsk fluid og en homogen blanding. Men disse aggregater sjældent set i det kapillære niveau (4-10 um i diameter) og er normalt en indikation af patologiske tilstande, såsom diabetes 6 og fedme. Andre patologiske tilstande, der kan ændre RBC sammenlægning omfatter inflammatoriske eller infektiøse tilstande,cardiovaskulære sygdomme, såsom hypertension eller aterosklerose, genetiske sygdomme og kroniske sygdomme 7. Derfor forstå RBC aggregeringsmekanismen og analyse af disse enheder (ved at definere et forhold mellem størrelsen af disse aggregater og strømningsforholdene) kan føre til en forståelse af den microrheological adfærd af blod og dermed relatere det til kliniske anvendelser.
RBC-aggregater kan ændres ved adskillige faktorer, såsom hæmatokrit (volumen af RBC'er i blod), forskydningshastigheden, kardiameteren, RBC membran stivhed og suspenderingsmediet sammensætning 8-10. Derfor er kontrollerede forhold kræves for effektivt at analysere RBC aggregater. Flere metoder er i stand til at analysere aggregatdannelse ved at give statiske sammenlægning målinger (sammenlægning index), der giver relevante oplysninger om blod adfærd. Disse fremgangsmåder indbefatter, bl.a. blodsænkningFremgangsmåde 11, lystransmissionen metode 12, lysrefleksion metode 13 og den lave forskydningsviskositet metode 14.
Kun få undersøgelser har forsøgt at studere RBC sammenlægning og bestemme graden af aggregering i kontrollerede strømningsforhold 15-17. Men disse undersøgelser indirekte undersøge RBC aggregerede størrelser ved at bestemme forholdet mellem den besatte plads i en klipning system, målt baseret på mikroskopiske blod billeder med oplysninger om graden af aggregering samt den lokale viskositet.
Vi har derfor præsentere en ny procedure for direkte at kvantificere RBC aggregater i mikrocirkulationen, dynamisk, under kontrollerede og konstante forskydningshastigheder. RBC-suspensioner medrives, i en dobbelt Y-mikrokanalplade (som illustreret i figur 1), med en phosphatpufret saltopløsning (PBS) opløsning dermed skabe en forskydningsstrømning i blodet lag. Inden dette blod lag en konstant shear sats kan opnås. RBC-suspensioner testes ved forskellige hæmatokrit (H) niveau (5%, 10% og 15%) og under forskellige forskydningshastigheder (2-11 sek -1). Blodet hastighed og forskydningshastighed bestemmes ved hjælp af et system, micro Particle billede Velocimetri (μPIV), mens strømmen visualiseres ved hjælp af en høj hastighed kamera. De opnåede resultater behandles derefter med en MATLAB kode baseret på billedstyrkerne for at detektere RBC'erne og bestemme aggregerede størrelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ved hjælp af denne metode er det muligt at analysere kvalitativt og kvantitativt RBC aggregater under forskellige strømningsforhold og hæmatokrit. For vellykket testning og samlede afsløring, er det afgørende at bestemme den passende forhold hastigheden mellem de to væsker ved mikrokanalplade indgang. Dette forhold er meget vigtigt at opnå en optimal blod lagtykkelse hvor hastighedsprofil er quasi-lineær 19.
En anden vigtig faktor for en vellykket test er en god billedkval…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af naturvidenskab og teknik Forskningsråd Canada. Mikrofabrikation blev udført med støtte fra McGill Nanotools MicroFab facilitet på McGill University og Department of Electronics ved Carleton University.
Materials
| SU8-50 epoxy based negative Photo-resist | MicroChem Corp. | ||
| SU8-50 developer | MicroChem Corp. | ||
| Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184 | Dow-Corning | 3097358-1004 | |
| PE-50 series Plasma system | Plasma Etch | PE-50 series | |
| Blood collection tubes with K2 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | FisherSci | B367861 | |
| Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 | Thermo Scientific | 004260F | |
| Poshpate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Tracer fluorescent particles solution (15 mL) | FisherSci | R800 | |
| Aggregometer | RheoMeditech | Rheo Scan AnD300 | |
| Glass syringes (50 µL) | Hamilton | 80965 | |
| Tubing (Tygon) | FisherSci | AAA00001 | |
| High speed camera (Basler) | Graftek Imaging Inc. | basler acA2000-340km | A camera capable of recording 18 frames per seconds could be used. |
| Double pulsed camera | LaVision | Imager Intense | |
| Microscope MITAS | LaVision | MITAS | |
| Nd:YAG laser | New Wave Research | Solo-II | |
| Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus) | Chemyx Inc. and Harvard Apparatus | Nexus3000 and PicoPlus | |
| DaVis software | LaVision | Davis |
References
- Perkkio, J., Keskinen, R. Hematocrit reduction in bifurcations due to plasma skimming. Bull. Math. Biol. 45 (1), 41-50 (1983).
- Chien, S., Jan, K. Ultrastructural basis of the mechanism of rouleaux formation. Microvasc. Res. 5 (2), 155-166 (1973).
- Neu, B., Meiselman, H. J. Depletion-mediated red blood cell aggregation in polymer solutions. Biophys. J. 83 (5), 2482-2490 (2002).
- Schmid-Schönbein, H., Gaehtgens, P., Hirsch, H. On the shear rate dependence of red cell aggregation in vitro. J. Clin. Invest. 47 (6), 1447-1454 (1968).
- Pries, A. R., Secomb, W. Rheology of the microcirculation. Clin. Hemorheol. Microcirc. 29 (3-4), 143-148 (2003).
- Baskurt, O. K., Neu, B., Meiselman, H. J. . Red Blood Cell Aggregation. , (2011).
- Cho, Y. I., Mooney, M. P., Cho, D. J. Hemorheological disorders in diabetes mellitus. J. Diabetes Sci. Technol. 2 (6), 1130-1138 (2008).
- Baskurt, O. K., Hardeman, M. R., Rampling, M. W., Meiselman, H. J. . Handbook of Hemorheology and Hemodynamics. , (2007).
- Lindqvist, T. The viscosity of the blood in narrow capillary tubes. Am. J. Physiol.-Legacy Content. 96, 562-568 (1931).
- Goldsmith, H. L., Cokelet, G. R., Gaehtgens, P. R. Fåhraeus: Evolution of his concepts in cardiovascular physiology. Am. J. Physiol. 257 (3), H1005-H1015 (1989).
- Fåhraeus, R. The suspension stability of the blood. Physiol. Rev. 9 (2), 241-274 (1929).
- Bauersachs, R. M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J. Determination of specific red blood cell aggregation indices via an automated system. Clin. Hemorheol. 9 (1), 1-25 (1989).
- Hardeman, M. R., Dobbe, J. G., Ince, C. The laser-assisted optical rotational cell analyzer (lorca) as red blood cell aggregometer. Clin. Hemorheol. Microcirc. 25 (1), 1-11 (2001).
- Rampling, M. W. Red cell aggregation and yield stress. Clinical Blood Rheology. , (1988).
- Dusting, J., Kaliviotis, E., Balabani, S., Yianneskis, M. Coupled human erythrocyte velocity field and aggregation measurements at physiological haematocrit levels. J. Biomech. 42 (10), 1438-1443 (2009).
- Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity: modelling using shear fields measured by a µPIV based technique. Med. Eng. Phys. 33 (7), 824-831 (2011).
- Sherwood, J. M., Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity and velocity distributions of aggregating and non-aggregating blood in a bifurcating microchannel. Biomech. Model. Mechan. 13 (2), 259-273 (2014).
- Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis. Clin. Hemorhol. Microcirc. 14 (4), 497-508 (1994).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie International Edition England. , 551-577 (1998).
- Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Design of a microfluidic system for red blood cell aggregation investigation. J. Biomech. Eng. 136 (6), 064501-1-064501-5 (2014).
- Pitts, K. L., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry for velocity profile measurements of micro blood flows. J. Vis. Exp. (74), e50314 (2013).
- Bitsch, L., Oleson, L. H., Westergaard, C. H., Bruus, H., Klank, H., Kutter, J. P. Micro particle-image velocimetry of bead suspensions and blood flows. Exp. Fluids. 39 (3), 507-513 (2005).
- Wereley, S. T., Gui, L., Meinhart, C. D. Advanced algorithms for microscale particle image velocimetry. AIAA J. 40 (6), 1047-1105 (2002).
- Nguyen, C. V., Fouras, A., Carberry, J. Improvement of measurement accuracy in micro PIV by image overlapping. Exp. Fluids. 49 (3), 701-712 (2010).
- Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods. Meas. Sci. Technol. 23 (10), 105302 (2012).
- Bhamare, M. G., Patil, D. S. Automatic blood cell analysis by using digital image processing: a preliminary study. Int. J. Eng. Res. Tech. 2 (9), 3135-3141 (2013).
- Maitra, M., Gupta, R. K., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using hough transform. Int. J. Comput. Appl. 53 (16), 18-22 (2012).
- Jambhekar, N. D. Red blood cells classification using image processing. Sci. Res. Repot. 1 (3), 151-154 (2011).
- Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Syst. Man. Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
