Environnement microfluidique contrôlée pour Dynamic Investigation of Blood Red Cell Agrégation
Summary
Le protocole décrit les détails d'une procédure expérimentale pour quantifier Red Blood Cell (RBC) agrégats sous un taux de cisaillement contrôlé et constant, basé sur des techniques de traitement d'image. L'objectif de ce protocole est de relier RBC tailles d'agrégats au taux de cisaillement correspondant dans un environnement microfluidique contrôlée.
Abstract
Le sang, comme un fluide biologique non newtonien, représente l'objet de nombreuses études dans le domaine de hémorhéologie. les constituants du sang comprennent les globules rouges, les globules blancs et de plaquettes qui sont en suspension dans le plasma sanguin. En raison de l'abondance des globules rouges (40% à 45% du volume du sang), leur comportement détermine le comportement rhéologique du sang en particulier dans la microcirculation. A taux de cisaillement très faibles, les globules rouges sont perçus à assembler et entités forment des agrégats appelés, ce qui provoque le comportement non-newtonien du sang. Il est important de comprendre les conditions de la formation d'agrégats de comprendre la rhéologie du sang dans la microcirculation. Le protocole décrit ici en détail la procédure expérimentale pour déterminer quantitativement les agrégats de RBC dans la microcirculation sous taux de cisaillement constant, basée sur le traitement d'image. A cet effet, RBC-suspensions sont testés et analysés en 120 x 60 um poly-diméthyl-siloxane (PDMS) microcanaux. Les suspensions sont RBC-entplu l'aide d'un deuxième fluide, afin d'obtenir un profil de vitesse linéaire à l'intérieur de la couche de sang et de réaliser ainsi une large gamme de taux de cisaillement constant. Le taux de cisaillement est déterminée en utilisant un système de micro Particle Image Velocimetry (μPIV), tandis que les agrégats de RBC sont visualisées en utilisant une caméra à haute vitesse. Les vidéos capturées des agrégats RBC sont analysées en utilisant des techniques de traitement d'image afin de déterminer les dimensions globales sur la base des intensités des images.
Introduction
Les globules rouges (hématies) jouent un rôle crucial dans la détermination du comportement rhéologique de sang. Ils sont presque singulièrement responsable des propriétés particulières du sang in vitro et in vivo. Dans des conditions physiologiques, les RBC occupent 40% à 45% du volume sanguin. Dans la microcirculation, les globules rouges ne occupent jusqu'à 20% du volume de sang en raison de diamètre des vaisseaux plus petits et le plasma écrémage effet 1. Ce phénomène de réduction du plasma dans la microcirculation est connu comme l'effet Fahraeus. A des taux de cisaillement faibles, les globules rouges sont en mesure de combler ensemble et former une ou dimensions des structures tridimensionnelles appelés "rouleaux" ou agrégats, contribuant ainsi au comportement non-newtonien du sang. Cependant, le mécanisme d'agrégation RBC est pas complètement compris. Deux théories existent pour modéliser l'agrégation des globules rouges: le pontage de la théorie des cellules due à la réticulation des macromolécules 2 et l'attrac de forcethéorie de l'épuisement tion provoquée par des molécules due au gradient osmotique 3.
Typiquement, pour le sang humain, des agrégats se forment à des taux de cisaillement très faibles 4 allant de 1 à 10 s -1. Au-dessus de cette gamme, les globules rouges ont tendance à désagréger et de débit séparément dans le navire.
Comprendre les conditions de la formation d'agrégats est d'une grande importance pour le domaine de hémorhéologie en termes de définition comportement rhéologique de sang. Ces agrégats sont souvent vus au niveau de macrocirculation (> 300 um de diamètre) 5. A cette échelle, le sang est considéré comme un fluide newtonien et d'un mélange homogène. Cependant, ces agrégats sont rarement observés dans le niveau capillaire (4-10 um de diamètre) et sont habituellement une indication d'états pathologiques tels que le diabète et l'obésité 6. Autres conditions pathologiques qui pourraient changer l'agrégation RBC inclut conditions inflammatoires ou infectieuses,les maladies cardiovasculaires telles que l'hypertension ou l'athérosclérose, les maladies génétiques et des maladies chroniques 7. Par conséquent, la compréhension du mécanisme d'agrégation RBC et l'analyse de ces entités (en définissant une relation entre la taille de ces agrégats et les conditions d'écoulement) peut conduire à la compréhension du comportement microrhéologiques de sang et par conséquent le relier à des applications cliniques.
RBC agrégats peuvent être modifiés par plusieurs facteurs tels que l'hématocrite (volume de globules rouges dans le sang), le taux de cisaillement, le diamètre du récipient, la raideur de la membrane RBC et la composition du milieu de mise en suspension 10.8. Par conséquent, des conditions contrôlées sont nécessaires afin d'analyser efficacement les agrégats de RBC. Plusieurs méthodes sont capables d'analyser la formation d'agrégats en fournissant des mesures d'agrégation statiques (indice d'agrégation) qui offre des informations pertinentes sur le comportement de sang. Ces procédés comprennent, entre autres, la vitesse de sédimentationProcédé selon 11, le procédé de transmission de lumière 12, le procédé de réflexion de lumière 13 et la méthode de viscosité à faible cisaillement 14.
Peu d'études ont tenté d'étudier l'agrégation RBC et de déterminer le degré d'agrégation dans des conditions d'écoulement contrôlées 15-17. Cependant, ces études examinent indirectement RBC tailles agrégées par la détermination du rapport de l'espace occupé dans un système de cisaillement mesurée à partir d'images microscopiques du sang fournissant des informations sur le degré d'agrégation, ainsi que la viscosité locale.
Nous présentons donc une nouvelle procédure de quantifier directement RBC regroupe la microcirculation, dynamiquement, en vertu des taux de cisaillement constante et contrôlée. RBC-suspensions sont entraînés, dans un double Y-microcanaux (comme cela est illustré sur la figure 1), avec un tampon phosphate salin (PBS) créant ainsi un écoulement de cisaillement dans la couche de sang. Dans ce sang couche A karité constantetaux de r peut être obtenue. Les suspensions de RBC sont testés à différents hématocrite (H) des niveaux (5%, 10% et 15%) et sous différents taux de cisaillement (11/02 sec -1). La vitesse du sang et le taux de cisaillement sont déterminées en utilisant un système de micro Particle Image Velocimetry (μPIV) tandis que le flux est visualisée à l'aide d'une caméra à haute vitesse. Les résultats obtenus sont ensuite traités avec un code MATLAB sur la base des intensités de l'image afin de détecter les globules rouges et de déterminer les dimensions globales.
Protocol
Representative Results
Discussion
En utilisant la méthodologie actuelle, il est possible d'analyser qualitativement et quantitativement la RBC regroupe sous différentes conditions d'écoulement et hématocrites. Pour le test avec succès et la détection globale, il est essentiel de déterminer le rapport de vitesse approprié entre les deux fluides à l'entrée du microcanal. Ce rapport est très important pour obtenir une épaisseur de couche de sang optimal où le profil de vitesse est quasi-linéaire 19.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Conseil de recherches en génie du Canada en sciences naturelles et. Microfabrication a été réalisée avec le soutien de l'installation McGill Nanotools Microfab à l'Université McGill et le département d'électronique de l'Université Carleton.
Materials
| SU8-50 epoxy based negative Photo-resist | MicroChem Corp. | ||
| SU8-50 developer | MicroChem Corp. | ||
| Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184 | Dow-Corning | 3097358-1004 | |
| PE-50 series Plasma system | Plasma Etch | PE-50 series | |
| Blood collection tubes with K2 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | FisherSci | B367861 | |
| Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 | Thermo Scientific | 004260F | |
| Poshpate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Tracer fluorescent particles solution (15 mL) | FisherSci | R800 | |
| Aggregometer | RheoMeditech | Rheo Scan AnD300 | |
| Glass syringes (50 µL) | Hamilton | 80965 | |
| Tubing (Tygon) | FisherSci | AAA00001 | |
| High speed camera (Basler) | Graftek Imaging Inc. | basler acA2000-340km | A camera capable of recording 18 frames per seconds could be used. |
| Double pulsed camera | LaVision | Imager Intense | |
| Microscope MITAS | LaVision | MITAS | |
| Nd:YAG laser | New Wave Research | Solo-II | |
| Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus) | Chemyx Inc. and Harvard Apparatus | Nexus3000 and PicoPlus | |
| DaVis software | LaVision | Davis |
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