Ambiente controllato Microfluidic per Dynamic Indagine Globulo rosso Aggregazione
Summary
Il protocollo descritto dettagli una procedura sperimentale per quantificare globuli rossi (RBC) aggregati con un gradiente di velocità controllata e costante, basato su tecniche di elaborazione delle immagini. L'obiettivo di questo protocollo è di mettere in relazione le dimensioni aggregate RBC al corrispondente gradiente di velocità in un ambiente controllato microfluidica.
Abstract
Il sangue, come BIOFLUID non newtoniano, rappresenta il fulcro di numerosi studi nel campo hemorheology. Componenti del sangue sono i globuli rossi, globuli bianchi e piastrine sospese in plasma sanguigno. Per l'abbondanza dei globuli rossi (40% al 45% del volume del sangue), il loro comportamento determina il comportamento reologico del sangue soprattutto nel microcircolo. Alla velocità di taglio molto basse, globuli rossi sono visti da montare e entità forma chiamata aggregati, che provoca il comportamento non newtoniano di sangue. È importante comprendere le condizioni di formazione aggregati di comprendere la reologia del sangue nel microcircolo. Il protocollo qui descritto in dettaglio la procedura sperimentale per determinare quantitativamente gli aggregati RBC in microcircolo sotto gradiente di velocità costante, sulla base di elaborazione delle immagini. A questo scopo, RBC-sospensioni sono testati e analizzati in 120 x 60 micron poly-dimetil-silossano (PDMS) microcanali. RBC-sospensioni sono entpiovuto utilizzando un secondo fluido al fine di ottenere un profilo di velocità lineare all'interno del livello del sangue e realizzare una vasta gamma di shear rate costante così. Il gradiente di velocità viene determinato utilizzando un sistema di micro Particle Image Velocimetry (μPIV), mentre gli aggregati RBC sono visualizzate con una fotocamera ad alta velocità. I video catturati degli aggregati RBC vengono analizzati utilizzando tecniche di elaborazione dell'immagine per determinare le dimensioni aggregati basati sulle immagini intensità.
Introduction
Globuli rossi (RBC) svolgono un ruolo cruciale nel determinare il comportamento reologico del sangue. Sono quasi singolarmente responsabili per le particolari proprietà di sangue in vitro e in vivo. In condizioni fisiologiche, RBC occupano il 40% al 45% del volume del sangue. In microcircolazione, globuli rossi solo occupano fino al 20% del volume di sangue a causa di diametri dei vasi più piccoli e il plasma effetto 1 scrematura. Questo fenomeno di riduzione plasma in microcircolazione è noto come effetto Fahraeus. A bassi tassi di taglio, eritrociti sono in grado di colmare e formare uno dimensionale o strutture tridimensionali denominate "rouleaux" o inerti, contribuendo così al comportamento non newtoniano di sangue. Tuttavia, il meccanismo di aggregazione RBC non è completamente noto. Due teorie esistono per modellare l'aggregazione dei GR: il ponte della teoria cellule causa la reticolazione delle macromolecole 2 e la forza attracteoria zione causata dalla deplezione delle molecole a causa del gradiente osmotico 3.
Tipicamente, per sangue umano, aggregati si formano a basse velocità di taglio 4 che vanno da 1 a 10 sec -1. Sopra questa gamma, globuli rossi tendono a disaggregare e il flusso separatamente all'interno del vaso.
La comprensione delle condizioni di formazione aggregati è di grande importanza per il campo hemorheology in termini di definizione comportamento reologico del sangue. Questi aggregati sono spesso visti a livello macrocircolo (> 300 micron di diametro) 5. A questa scala, il sangue è considerato come un fluido Newtoniano e una miscela omogenea. Tuttavia, questi aggregati sono raramente nel livello capillare (4-10 micron di diametro) e sono solitamente un'indicazione di condizioni patologiche come il diabete 6 e obesità. Altre condizioni patologiche che potrebbero cambiare l'aggregazione RBC includono malattie infiammatorie o infettive,malattie cardiovascolari come l'ipertensione o aterosclerosi, malattie genetiche e le malattie croniche 7. Pertanto, la comprensione del meccanismo di aggregazione RBC e analizzare queste entità (definendo una relazione tra la dimensione di tali aggregati e le condizioni di flusso) potrebbe portare alla comprensione del comportamento microrheological di sangue e quindi in relazione con applicazioni cliniche.
Aggregati RBC possono essere alterate da diversi fattori come il ematocrito (volume di globuli rossi nel sangue), la velocità di taglio, il diametro del vaso, la membrana rigidità RBC e la sospensione tessitura media 8-10. Pertanto, condizioni controllate sono necessari per analizzare efficacemente gli aggregati RBC. Diversi metodi sono in grado di analizzare la formazione di aggregati fornendo misurazioni aggregazione statiche (indice di aggregazione) che offre informazioni utili sul comportamento del sangue. Questi metodi includono, tra l'altro, il tasso di sedimentazione degli eritrocitiMetodo 11, il metodo di trasmissione della luce 12, il metodo di riflessione della luce 13 e il metodo a bassa viscosità di taglio 14.
Pochi studi hanno cercato di studiare l'aggregazione RBC e determinare il grado di aggregazione in condizioni di flusso controllato 15-17. Tuttavia, questi studi indirettamente indagare RBC formati aggregati determinando il rapporto dello spazio occupato in un sistema di taglio misurata basato su immagini microscopiche sanguigni che forniscono informazioni sul grado di aggregazione e la viscosità locale.
Abbiamo quindi presentiamo una nuova procedura per quantificare direttamente RBC aggrega in microcircolo, in modo dinamico, con tassi di taglio controllate e costanti. RBC-sospensioni sono trascinati, in un doppio Y-microchannel (come illustrato in figura 1), con una soluzione di tampone fosfato (PBS) creando così un flusso di taglio nello strato di anima. All'interno di questo sangue strato un costante karitétasso r può essere ottenuto. Gli RBC-sospensioni sono testati a diverso ematocrito (H) livelli (5%, 10% e 15%) e in differenti velocità di taglio (2-11 sec -1). La velocità sanguigna e la frequenza di taglio sono determinati utilizzando un sistema di micro Particle Image Velocimetry (μPIV) mentre il flusso viene visualizzato per mezzo di una telecamera ad alta velocità. I risultati ottenuti vengono poi elaborati con un codice MATLAB sulla base delle intensità di immagine al fine di rilevare i globuli rossi e determinare le dimensioni aggregate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizzando il presente metodo, è possibile analizzare qualitativamente e quantitativamente la RBC aggrega in diverse condizioni di flusso e ematocriti. Per le prove di successo e rilevamento aggregato, è cruciale per determinare il rapporto di trasmissione appropriato tra i due fluidi all'ingresso microcanali. Questo rapporto è molto importante per ottenere uno spessore strato sangue ottimale in cui il profilo di velocità è quasi lineare 19.
Un altro fattore chiave per i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dai scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada. Microfabbricazione è stata effettuata con il supporto della struttura McGill Nanotools MicroFab alla McGill University e il Dipartimento di Elettronica presso la Carleton University.
Materials
| SU8-50 epoxy based negative Photo-resist | MicroChem Corp. | ||
| SU8-50 developer | MicroChem Corp. | ||
| Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184 | Dow-Corning | 3097358-1004 | |
| PE-50 series Plasma system | Plasma Etch | PE-50 series | |
| Blood collection tubes with K2 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | FisherSci | B367861 | |
| Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 | Thermo Scientific | 004260F | |
| Poshpate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Tracer fluorescent particles solution (15 mL) | FisherSci | R800 | |
| Aggregometer | RheoMeditech | Rheo Scan AnD300 | |
| Glass syringes (50 µL) | Hamilton | 80965 | |
| Tubing (Tygon) | FisherSci | AAA00001 | |
| High speed camera (Basler) | Graftek Imaging Inc. | basler acA2000-340km | A camera capable of recording 18 frames per seconds could be used. |
| Double pulsed camera | LaVision | Imager Intense | |
| Microscope MITAS | LaVision | MITAS | |
| Nd:YAG laser | New Wave Research | Solo-II | |
| Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus) | Chemyx Inc. and Harvard Apparatus | Nexus3000 and PicoPlus | |
| DaVis software | LaVision | Davis |
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