Контролируемая Микрожидкостных Окружающая среда для динамического исследования эритроцитов агрегации

Summary

Протокол, описанный подробности экспериментальную процедуру количественного Красный клеток крови (эритроцитов) агрегаты в контролируемой и постоянной скоростью сдвига, на основе методов обработки изображений. Целью данного протокола является отношение RBC размеры агрегатные к соответствующей скорости сдвига в контролируемой среде микрожидком.

Abstract

Кровь, как неньютоновской биожидкости, представляет собой фокус многочисленных исследований в области гемореологии. Компонентов крови включают красные кровяные клетки, белые кровяные клетки и тромбоциты, которые взвешенных в плазме крови. Из-за обилия эритроцитов (от 40% до 45% от объема крови), их поведение диктует реологические свойства крови, особенно в микроциркуляции. При очень низких скоростях сдвига, эритроциты видел, чтобы собрать и форма лица называется агрегатов, что приводит к неньютоновской поведение крови. Важно понять условия формирования агрегатов понять реологические свойства крови в микроциркуляции. Протокол, описанный здесь подробно экспериментальную процедуру, чтобы определить количественно агрегатов эритроцитов в микроциркуляции под постоянной скорости сдвига, на основе обработки изображений. Для этой цели RBC-суспензии испытаны и проанализированы в 120 х 60 мкм поли-диметил-силоксан (PDMS) микроканалов. РБК-суспензий ЛОРдождь с использованием второй текучей среды, чтобы получить линейный профиль скорости в слое крови и, таким образом, достичь широкого спектра постоянных скоростях сдвига. Скорость сдвига определяется с помощью микро Velocimetry Particle Image (μPIV) системы, в то время как РБК агрегаты визуализированы с помощью высокоскоростной камеры. В видеозаписи, сделанные из агрегатов эритроцитов проанализированы с использованием методов обработки изображений, чтобы определить совокупные размеры, основанные на интенсивности изображений.

Introduction

Красные клетки крови (эритроцитов) играют решающую роль в определении реологические свойства крови. Они почти сингулярно ответственность за особых свойств крови в пробирке и в естественных условиях. В физиологических условиях, эритроциты занимают от 40% до 45% от объема крови. В микроциркуляции, только БС занимать до 20% объема крови за счет меньшего диаметра сосудов и плазме скользя эффекта ^1. Это явление снижения плазмы в микроциркуляции известно как эффект Fåhræus. При низких скоростях сдвига, эритроциты способны преодолеть вместе и образуют одномерное или трехмерные структуры, называемые "неустойчивых агрегатов эритроцитов" или агрегаты, следовательно, вносит свой вклад в неньютоновской поведение крови. Тем не менее, механизм агрегации эритроцитов не полностью изучены. Две теории существуют для моделирования агрегацию эритроцитов: мостиковых теории клеток из-за сшивки макромолекул ² и сила привлеТеория ние вызвано истощение молекул в результате осмотическому градиенту ^3.

Как правило, для человеческой крови, агрегаты образуются при очень низких скоростях сдвига ⁴ в пределах от 1 до 10 с ^-1. Выше этого диапазона, эритроциты, как правило, дезагрегации и потока отдельно в сосуде.

Понимание условий образования агрегатов имеет большое значение для области гемореологии с точки зрения определения реологических свойств крови;. Эти агрегаты часто видели на уровне макроциркуляционного (> диаметром 300 мкм) ^5. В этом масштабе, кровь считается ньютоновской жидкости и однородной смеси. Тем не менее, эти агрегаты редко можно увидеть в капиллярном уровне (4-10 мкм в диаметре) и, как правило, свидетельствует о патологических состояний, таких как диабет и ожирение ^6. Другие патологические состояния, которые могут изменить агрегации РБК включают воспалительные или инфекционные условия,сердечно-сосудистые заболевания, такие как гипертония или атеросклероз, генетических нарушений и хронических заболеваний. ⁷ Таким образом, понимая, что механизм агрегации эритроцитов и анализа этих объектов (путем определения отношения между размером этих агрегатов и условий потока) может привести к пониманию микрореологических поведения крови и, следовательно, отношение его к клинической практике.

RBC агрегаты могут быть изменены с помощью нескольких факторов, таких как гематокрита (объема эритроцитов в крови), скорость сдвига, диаметра сосуда, в жесткости мембраны эритроцитов и суспендирующей среды состава ^8-10. Таким образом, контролируемые условия необходимы для того, чтобы эффективно анализировать агрегаты РБК. Некоторые методы способны анализировать совокупную образование путем предоставления статических измерений агрегации (индекс агрегации), который предлагает соответствующую информацию о поведении крови. Эти методы включают в себя, в частности, скорость оседания эритроцитовМетод ^11, способ передачи света ^12, метод отражения света ¹³ и ¹⁴ Способ вязкость низкой скорости сдвига.

Несколько исследований пытались изучать агрегацию эритроцитов и определить степень агрегации в контролируемых условиях потока ^15-17. Тем не менее, эти исследования косвенно исследовать РБК совокупные размеры, определяя отношение занятого пространства в системе сдвига измеряется на основе микроскопических изображений, обеспечивающих крови информацию о степени агрегации, а также местного вязкости.

Поэтому мы представляем новую процедуру непосредственно количественно РБК агрегатов микроциркуляции, динамично, в контролируемых и постоянных скоростях сдвига. RBC-суспензии увлекаются, в двойной Y-микроканала (как показано на рисунке 1), с фосфатным буферным солевым раствором (PBS), решение, следовательно, создания сдвигового течения в слое крови. В этой крови слой постоянный Шиаг ставка может быть получена. В RBC-суспензии тестировали при различной гематокрита (H) уровней (5%, 10% и 15%) и при различных скоростях сдвига (2-11 сек ^-1). Скорость крови и скорость сдвига определяется с использованием микро Velocimetry частиц изображения (μPIV) системы, а поток визуализировали с использованием высокоскоростной камеры. Полученные результаты затем обрабатываются с помощью кода MATLAB на основе интенсивности изображения для обнаружения БС и определять совокупные размеры.

Protocol

Кровь собирают от здоровых лиц с одобрения комитета по этике Университета Оттавы (H11-13-06). 1. Изготовление Микроканальные В микроканалы изготовлены на основе стандартных методов фотолитографии 18. Дизайн геометрию микроканального используя ди?…

Representative Results

Пример потока двух жидкости в двойной Y-микроканале показано на рисунке 2 для человека эритроцитов, взвешенных в 5%, 10% и 15% гематокрита и впадающих в 10 мкл / ч. Рисунок 3 показывает разницу в совокупных размеров, когда поток в канале снижается с 10 мкл / ч в 5 мкл / ч в течение ?…

Discussion

С помощью настоящего методику, можно проанализировать качественно и количественно эритроцитов агрегатов при различных условиях потока и гематокрита. Для успешного тестирования и совокупного обнаружения, важно, чтобы определить соответствующий коэффициент скорости между двумя жидк…

Materials

SU8-50 epoxy based negative Photo-resist	MicroChem Corp.
SU8-50 developer	MicroChem Corp.
Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184	Dow-Corning	3097358-1004
PE-50 series Plasma system	Plasma Etch	PE-50 series
Blood collection tubes with K2 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	FisherSci	B367861
Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2	Thermo Scientific	004260F
Poshpate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Tracer fluorescent particles solution (15 mL)	FisherSci	R800
Aggregometer	RheoMeditech	Rheo Scan AnD300
Glass syringes (50 µL)	Hamilton	80965
Tubing (Tygon)	FisherSci	AAA00001
High speed camera (Basler)	Graftek Imaging Inc.	basler acA2000-340km	A camera capable of recording 18 frames per seconds could be used.
Double pulsed camera	LaVision	Imager Intense
Microscope MITAS	LaVision	MITAS
Nd:YAG laser	New Wave Research	Solo-II
Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus)	Chemyx Inc. and Harvard Apparatus	Nexus3000 and PicoPlus
DaVis software	LaVision	Davis