Kontrollerad Mikrofluidumanordning Miljö för Dynamic Undersökning av röda blodkroppar Sammanläggning
Summary
Det protokoll som beskrivits detaljer en experimentell procedur för att kvantifiera röda blodkroppar (RBC) aggregat under kontrollerad och konstant skjuvhastighet, baserat på bildbehandlingstekniker. Målet med detta protokoll är att relatera RBC aggregatstorlekar att motsvarande skjuvhastighet i en kontrollerad mikroflödes miljö.
Abstract
Blod, som en icke-newtonsk biofluid, representerar i fokus för ett stort antal studier på hemorheology fältet. Blodbeståndsdelar inkluderar röda blodkroppar, vita blodkroppar och blodplättar som är suspenderade i blodplasma. På grund av överflödet av de röda blodkropparna (40% till 45% av blodvolymen), deras beteende dikterar det reologiska beteendet hos blod i synnerhet i mikrocirkulationen. Vid mycket låga skjuvhastigheter, är RBK ses att montera och bildar enheter som kallas aggregat, vilket bringar icke-newtonskt beteende av blod. Det är viktigt att förstå villkoren för aggregat bildandet att förstå blodet reologi i mikro. Protokollet som beskrivs här detaljer den experimentella proceduren för att bestämma kvantitativt RBC aggregaten i mikrocirkulationen under konstant skjuvhastighet, baserat på bildbehandling. För detta ändamål är RBC-suspensioner testas och analyseras i 120 x 60 ^ m poly-dimetyl-siloxan (PDMS) mikrokanaler. The RBC-suspensioner är entregnade användning av en andra vätska för att erhålla en linjär hastighetsprofil inuti blodskiktet och därmed uppnå ett brett utbud av konstanta skjuvhastigheter. Skjuvhastigheten bestäms med användning av en mikro Particle Image Velocimetry (μPIV) system, medan RBC aggregat visualiseras med hjälp av en höghastighetskamera. Filmerna tagna av RBC aggregaten analyseras med användning av bildbehandlingstekniker för att bestämma aggregatstorlekar baserade på de bilder intensiteter.
Introduction
Röda blodkroppar (RBC) spelar en avgörande roll för att bestämma det reologiska beteendet hos blod. De är nästan ovanligt ansvariga för de speciella egenskaperna hos blod in vitro och in vivo. Under fysiologiska betingelser, RBCs upptar 40% till 45% av blodvolymen. I mikrocirkulationen, bara RBC ockupera upp till 20% av blodvolymen på grund av mindre fartyg diametrar och plasma skimming effekt 1. Detta fenomen med minskning plasma i mikrocirkulationen är känd som Fåhraeus effekten. Vid låga skjuvhastigheter, RBC kan överbrygga tillsammans och bilda en dimensionell eller tre dimensionella strukturer som kallas "rouleaux" eller aggregat därför bidrar till den icke-newtonska beteendet hos blod. Emellertid är mekanismen för RBC aggregering inte fullständigt klarlagd. Två teorier finns för att modellera sammanläggning av de röda blodkropparna: att överbrygga celler teori på grund av tvärbindning av makromolekyler 2 och kraften attraktionsteori orsakad av utarmning av molekylerna på grund av den osmotiska gradienten 3.
Typiskt för humanblod, aggregat bildas vid mycket låga skjuvhastigheter 4 intervallet från 1 till 10 sek -1. Ovanför detta område, RBC tenderar att dela upp och strömma separat inuti kärlet.
Förstå villkoren för aggregat bildning är av stor betydelse för hemorheology villkor när det gäller att definiera blodets reologiskt beteende. Dessa aggregat ses ofta på makrocirkulationen nivå (> 300 um diameter) 5. Vid denna skala, blod betraktas som en newtonsk vätska och en homogen blandning. Emellertid är dessa aggregat sällan i kapillären nivå (4-10 | j, m i diameter) och är vanligtvis ett tecken på patologiska tillstånd såsom diabetes 6 och fetma. Andra patologiska tillstånd som kan förändra RBC aggregering innefattar inflammatoriska eller infektiösa tillstånd,kardiovaskulära sjukdomar, såsom högt blodtryck eller åderförkalkning, genetiska sjukdomar och kroniska sjukdomar 7. Därför kan förstå aggregationsmekanismen RBC och analysera dessa enheter (genom att definiera en relation mellan storleken på dessa aggregat och strömningsförhållandena) leda till förståelsen av microrheological beteende av blod och därmed relatera det till kliniska tillämpningar.
RBC aggregat kan förändras genom flera faktorer, såsom hematokrit (volymen av RBC i blod), skjuvhastigheten, kärldiametern, RBC membranstelhet och suspensionsmediet kompositionen 8-10. Därför är kontrollerade betingelser som krävs för att effektivt analysera RBC aggregaten. Flera metoder har möjlighet att analysera aggregatbildning genom att ge statiska mätningar aggregering (aggregering index) som erbjuder relevant information om blod beteende. Dessa metoder inkluderar, bland annat, den sänkningsreaktionmetod 11, ljusöverföringsmetoden 12, den ljusreflektion metoden 13 och viskositeten metoden 14 låg skjuvning.
Få studier har försökt att studera RBC aggregering och bestämma graden av aggregering under kontrollerade flödesförhållanden 15-17. Men dessa studier indirekt undersöka RBC sammanlagda storlekar genom att bestämma förhållandet mellan den ockuperade utrymme i en skärsystemet mäts utifrån mikroskopiska blod bilder som ger information om graden av aggregering samt den lokala viskositeten.
Vi presenterar därför ett nytt förfarande för att direkt kvantifiera RBC aggregat i mikro, dynamiskt under kontrollerade och konstanta skjuvhastigheter. RBC-suspensioner medbringas, i en dubbel Y-mikrokanal (såsom visas i fig 1), med en fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning därmed skapa ett skjuvflöde i blodskiktet. Inom detta blod skikt en konstant shear hastighet kan erhållas. The RBC-suspensioner testas vid olika hematokrit (H) nivå (5%, 10% och 15%) och under olika skjuvningshastigheter (2-11 sek -1). Blodhastigheten och skjuvhastighet bestämmes med användning av en mikro Particle Image Velocimetry (μPIV) systemet medan flödet visualiseras med hjälp av en höghastighetskamera. De erhållna resultaten behandlas sedan med ett MATLAB-kod baserat på de bildintensitet för att detektera de röda blodkropparna och bestämma aggregatstorlekar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med användning av föreliggande metod, är det möjligt att analysera kvalitativt och kvantitativt RBC aggregat under olika strömningsförhållanden och hematokriter. För framgångsrika tester och samlade upptäckt, är det viktigt att bestämma lämplig hastighetsförhållandet mellan de båda vätskorna på mikro posten. Detta förhållande är mycket viktigt att uppnå en optimal blodskikttjocklek där hastighetsprofilen är kvasi-linjär 19.
En annan viktig faktor för fram…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada. Mikro utfördes med stöd av McGill Nanotools Microfab anläggning vid McGill University och Institutionen för elektronik vid Carleton University.
Materials
| SU8-50 epoxy based negative Photo-resist | MicroChem Corp. | ||
| SU8-50 developer | MicroChem Corp. | ||
| Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184 | Dow-Corning | 3097358-1004 | |
| PE-50 series Plasma system | Plasma Etch | PE-50 series | |
| Blood collection tubes with K2 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | FisherSci | B367861 | |
| Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 | Thermo Scientific | 004260F | |
| Poshpate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Tracer fluorescent particles solution (15 mL) | FisherSci | R800 | |
| Aggregometer | RheoMeditech | Rheo Scan AnD300 | |
| Glass syringes (50 µL) | Hamilton | 80965 | |
| Tubing (Tygon) | FisherSci | AAA00001 | |
| High speed camera (Basler) | Graftek Imaging Inc. | basler acA2000-340km | A camera capable of recording 18 frames per seconds could be used. |
| Double pulsed camera | LaVision | Imager Intense | |
| Microscope MITAS | LaVision | MITAS | |
| Nd:YAG laser | New Wave Research | Solo-II | |
| Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus) | Chemyx Inc. and Harvard Apparatus | Nexus3000 and PicoPlus | |
| DaVis software | LaVision | Davis |
References
- Perkkio, J., Keskinen, R. Hematocrit reduction in bifurcations due to plasma skimming. Bull. Math. Biol. 45 (1), 41-50 (1983).
- Chien, S., Jan, K. Ultrastructural basis of the mechanism of rouleaux formation. Microvasc. Res. 5 (2), 155-166 (1973).
- Neu, B., Meiselman, H. J. Depletion-mediated red blood cell aggregation in polymer solutions. Biophys. J. 83 (5), 2482-2490 (2002).
- Schmid-Schönbein, H., Gaehtgens, P., Hirsch, H. On the shear rate dependence of red cell aggregation in vitro. J. Clin. Invest. 47 (6), 1447-1454 (1968).
- Pries, A. R., Secomb, W. Rheology of the microcirculation. Clin. Hemorheol. Microcirc. 29 (3-4), 143-148 (2003).
- Baskurt, O. K., Neu, B., Meiselman, H. J. . Red Blood Cell Aggregation. , (2011).
- Cho, Y. I., Mooney, M. P., Cho, D. J. Hemorheological disorders in diabetes mellitus. J. Diabetes Sci. Technol. 2 (6), 1130-1138 (2008).
- Baskurt, O. K., Hardeman, M. R., Rampling, M. W., Meiselman, H. J. . Handbook of Hemorheology and Hemodynamics. , (2007).
- Lindqvist, T. The viscosity of the blood in narrow capillary tubes. Am. J. Physiol.-Legacy Content. 96, 562-568 (1931).
- Goldsmith, H. L., Cokelet, G. R., Gaehtgens, P. R. Fåhraeus: Evolution of his concepts in cardiovascular physiology. Am. J. Physiol. 257 (3), H1005-H1015 (1989).
- Fåhraeus, R. The suspension stability of the blood. Physiol. Rev. 9 (2), 241-274 (1929).
- Bauersachs, R. M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J. Determination of specific red blood cell aggregation indices via an automated system. Clin. Hemorheol. 9 (1), 1-25 (1989).
- Hardeman, M. R., Dobbe, J. G., Ince, C. The laser-assisted optical rotational cell analyzer (lorca) as red blood cell aggregometer. Clin. Hemorheol. Microcirc. 25 (1), 1-11 (2001).
- Rampling, M. W. Red cell aggregation and yield stress. Clinical Blood Rheology. , (1988).
- Dusting, J., Kaliviotis, E., Balabani, S., Yianneskis, M. Coupled human erythrocyte velocity field and aggregation measurements at physiological haematocrit levels. J. Biomech. 42 (10), 1438-1443 (2009).
- Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity: modelling using shear fields measured by a µPIV based technique. Med. Eng. Phys. 33 (7), 824-831 (2011).
- Sherwood, J. M., Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity and velocity distributions of aggregating and non-aggregating blood in a bifurcating microchannel. Biomech. Model. Mechan. 13 (2), 259-273 (2014).
- Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis. Clin. Hemorhol. Microcirc. 14 (4), 497-508 (1994).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie International Edition England. , 551-577 (1998).
- Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Design of a microfluidic system for red blood cell aggregation investigation. J. Biomech. Eng. 136 (6), 064501-1-064501-5 (2014).
- Pitts, K. L., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry for velocity profile measurements of micro blood flows. J. Vis. Exp. (74), e50314 (2013).
- Bitsch, L., Oleson, L. H., Westergaard, C. H., Bruus, H., Klank, H., Kutter, J. P. Micro particle-image velocimetry of bead suspensions and blood flows. Exp. Fluids. 39 (3), 507-513 (2005).
- Wereley, S. T., Gui, L., Meinhart, C. D. Advanced algorithms for microscale particle image velocimetry. AIAA J. 40 (6), 1047-1105 (2002).
- Nguyen, C. V., Fouras, A., Carberry, J. Improvement of measurement accuracy in micro PIV by image overlapping. Exp. Fluids. 49 (3), 701-712 (2010).
- Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods. Meas. Sci. Technol. 23 (10), 105302 (2012).
- Bhamare, M. G., Patil, D. S. Automatic blood cell analysis by using digital image processing: a preliminary study. Int. J. Eng. Res. Tech. 2 (9), 3135-3141 (2013).
- Maitra, M., Gupta, R. K., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using hough transform. Int. J. Comput. Appl. 53 (16), 18-22 (2012).
- Jambhekar, N. D. Red blood cells classification using image processing. Sci. Res. Repot. 1 (3), 151-154 (2011).
- Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Syst. Man. Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
