In vivo og ex vivo Approaches at studere kræft i æggestokkene Metastatisk Kolonisering af Milky Spot Strukturer i peritoneal Adipose

Summary

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

Abstract

High-grade serøs æggestokkræft (HGSC), årsagen til udbredte peritoneale metastaser, fortsætter med at have en yderst dårlig prognose; færre end 30% af kvinderne er i live 5 år efter diagnosen. Omentum er en foretrukken stedet for HGSC metastasedannelse. På trods af den kliniske betydning af dette mikromiljø, bidrag oment fedtvæv til ovariecancer progression forbliver dublerede. Oment fedtvæv er usædvanlig, idet den indeholder strukturer kendt som matte pletter, der består af B, T, og NK-celler, makrofager og progenitorceller omgivende tætte reder af vaskulatur. Matte pletter spiller en central rolle i de fysiologiske funktioner af omentum, som er nødvendige for peritoneal homeostase. Vi har vist, at matte pletter også fremme æggestokkene metastatisk kolonisering af peritoneal fedt, et vigtigt skridt i udviklingen af ​​peritoneale metastaser. Her beskriver vi fremgangsmåder udviklede vi at evaluere og kvantificere matte pletter i pritoneal adipøse væv og undersøge deres funktionelle bidrag til ovariecancercelle metastatisk kolonisering af oment væv både in vivo og ex vivo. Disse metoder er generaliseres til yderligere musemodeller og cellelinjer, hvilket muliggør studiet af ovariecancer metastasedannelse fra den indledende lokalisering af celler til mælkeagtige spot strukturer til udvikling af udbredte peritoneale metastaser.

Introduction

I modsætning til de fleste faste tumorer, er metastaser fra høj kvalitet serøs ovariecancer (HGSC) begrænset til bughulen ^1. Således kunne effektive peritoneale behandlingsformer potentielt kontrollere eller udrydde HGSC. I øjeblikket, en standard terapeutisk tilgang er kirurgisk cytoreduktion kombineret med kemoterapi ^1-3. Desværre langt de fleste patienter oplever og bukke under for komplikationer af recidiv. Disse dystre statistikker viser behovet for bedre forståelse af metastatisk kolonisering, den proces, hvorved cancerceller lokalisere til, udnytte, og formere sig inden værtsvæv at danne metastaser ^2.

Omentum er et foretrukket sted for tidligt HGSC metastaser ^4-7. I modsætning til andre peritoneal fedt, oment fedtvæv indeholder usædvanlige immune strukturer kendt som mælkeagtige pletter, der indeholder B, T og NK-celler og makrofager, som spiller vigtige roller i peritoneale homeosTASIS ^8,9. Ud over deres fysiologiske funktioner, fandt vi, at matte pletter spille en aktiv rolle i æggestokkræft metastatisk kolonisering ^4. I eksperimentelle metastase assays, SKOV3ip.1, CaOV3 og HeyA8 (human) og ID8 (murine; C57BL / 6) ovariecancerceller hurtigt hjem til mælkeagtige pletter, hvilket tyder på, at cellerne bevæger sig i retning af et udskilt kemotaktisk faktor. Interessant, behøver kræftceller ikke kolonisere peritoneal fedt mangler mælkeagtige pletter (dvs. gonadale og uterin fedt) ^4.

For at identificere mekanismer, der regulerer mælkeagtig spot kolonisering, har vi optimeret xenograftmodeller der muliggør afhøringen af cellulære og molekylære begivenheder over tidsforløbet af metastatisk kolonisering ^4. En særlig fordel af de tilgange, der er beskrevet heri, er dens vægt på væv arkitektur og funktion, som giver brugerne mulighed for at afprøve hypoteser i fuldt integreret in vivo og ex vivo-modeller af metastatic kolonisering ^4,10. Ved at sammenligne kræftcellen lokalisering og vækst i peritoneale fedtdepoter, som enten indeholder eller mangler matte pletter, kan efterforskerne teste relative bidrag (e) af adipocytter og celler inden mælkeagtige pletter til logi og progressiv vækst ovariecancerceller i fysiologisk relevante væv.

Protocol

Alle mus blev opstaldet, vedligeholdes og aflives efter Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) retningslinjer og under tilsyn af University of Chicago Animal Resource Center. 1. Forberedelse dyr til forsøg Studies Tillad dyr at akklimatisere sig til nye boliger og miljø, til at komme sig fra potentielle fysiologiske virkninger af transport og håndtering. Bemærk: Følgende teknik er gældende for alle kommercielt tilgængelige stammer af mus. Antallet af dyr, d…

Representative Results

Identifikation og histologisk undersøgelse af Peritoneale fedtdepoter Gross anatomisk dissektion muliggør identifikation af fire af de fem primære kilder til peritoneal fedt (figur 1A). Flytning uret fra øverst i midten er: omentum (OM; skitseret) placeret over maven og milt, den gonadale fedt (GF), der omgiver venstre æggestok (ov), uterin fedt (UF) fastgjort til livmoderhornene (uh) og mesenterium (MY) fastgjort til tyndtarmen (si). Æggestokken (ov),…

Discussion

Udvikling af behandlinger til at målrette disseminerede celler kræver en mekanistisk forståelse af metastatisk kolonisering, det kritiske første skridt i udviklingen af peritoneal sygdom. For at løse disse problemer, vi rapporterer tilgange, der kan bruges til at skelne, hvordan omentum unikke væv sammensætning og arkitektur fremmer ovariecancer metastatisk kolonisering. Særlige kendetegn ved vores tilgang er: 1) fokus på tidlige begivenheder i koloniseringen processen; 2) sammenligning af mælkeagtige…

Materials

Dissection Tools	Fine Science Tools	NA
Geimsa	Fluka/Sigma Aldrich	48900
5% Formalin	Sigma	HT501320
DMEM	Corning	10-013-CV
Trypsin	Gibco	25200-056
PBS	Corning	21-040-CV	Without calcium and Magnesium
26 gauge needle	BD	329652
BSA	Sigma	A7906
Collagenase	Worthington	LS004196
Stomacher	Seward Labsystems	Stomacher 80 Biomaster
Microstomacher bag	Stomacher Lab Systems	BA6040/Micro
ACK Lysis Buffer	Gibco	A10492-01
Millicell culture plate insert	Millipore	PICM01250
Cell-Tak	BD	354240