Periventricular वयस्क चूहे के क्षेत्र और मानव रीढ़ की हड्डी से तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के अलगाव
Summary
The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.
Abstract
वयस्क चूहे और वृद्धि कारक समृद्ध माध्यम में सुसंस्कृत मानव रीढ़ की हड्डी तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (NSPCs), स्वयं renewing, और विस्तार तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं multipotent के प्रसार के लिए अनुमति देता है। सीरम स्थितियों में, इन multipotent NSPCs न्यूरॉन्स, astrocytes, और oligodendrocytes पैदा करने, अलग होगा। काटा ऊतक bFGF (enzymatically एक papain-EDTA समाधान में अलग और फिर यंत्रवत् epidermal वृद्धि कारक (EGF) के साथ पूरक Neurobasal मध्यम, बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक के रूप में चढ़ाया जाता है, जो एक एकल कक्ष निलंबन की उपज के लिए अलग और एक असंतत घनत्व ढाल के माध्यम से अलग किया जाता है ), और हेपरिन। वयस्क चूहे रीढ़ की हड्डी NSPCs पक्षपाती संस्कृतियों के रूप में बड़े हो रहे हैं मुक्त अस्थायी neurospheres और वयस्क मानव रीढ़ की हड्डी NSPCs के रूप में संवर्धित कर रहे हैं। इन शर्तों के तहत, वयस्क रीढ़ की हड्डी NSPCs अग्रदूत साबित कोशिकाओं के व्यक्त मार्करों, पैदा करना, और लगातार बीतने पर विस्तार किया जा सकता है। इन कोशिकाओं को ख कर सकते हैंई विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में इन विट्रो में अध्ययन किया है, और exogenous कारकों तंत्रिका स्टेम सेल भेदभाव की जांच करने के वंश प्रतिबंध को बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Multipotent NSPCs या उनके वंशज भी पुनर्योजी मरम्मत का आकलन करने के लिए विभिन्न पशु मॉडल में प्रत्यारोपित किया जा सकता है।
Introduction
NSPCs स्वयं को नवीनीकृत और आसानी से इन विट्रो में विस्तार कर सकते हैं कि तंत्रिका वंश के लिए प्रतिबद्ध multipotent कोशिकाओं रहे हैं। वे स्वयं renewing multipotent स्टेम कोशिकाओं और अधिक प्रतिबंधित progenitors के गुणों को प्रदर्शित बाद से हम न्यूरल स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के एक मिश्रित आबादी के रूप में इन कोशिकाओं को देखें। NSPCs भ्रूण और वयस्क मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी 1,2 दोनों में पाए जाते हैं। वयस्क में, NSPCs सामान्य रूप से मौन हैं और पार्श्व निलय 2-4 अस्तर subventricular क्षेत्र, और रीढ़ की हड्डी 5,6 के मध्य नहर के आसपास के periventricular क्षेत्र सहित विशिष्ट niches के भीतर रहते हैं।
आमतौर पर, NSPCs EGF और bFGF के साथ पूरक सीरम मुक्त माध्यम में मुक्त अस्थायी neurospheres के रूप में या पक्षपाती monolayers, स्टेम / पूर्वज सेल आबादी के लिए चयन करें जो mitogens के रूप में संवर्धित कर रहे हैं। मूल रूप से रेनॉल्ड्स और वेइस 2 द्वारा विकसित neurosphere परख, सबसे अधिक संस्कृति के लिए प्रयोग किया जाता है औरतंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का विस्तार। वे विकास का पहलू मुक्त माध्यम से युक्त सीरम में चढ़ाया जाता है जब NSPCs न्यूरॉन्स, astrocytes, और oligodendrocytes में फर्क, multipotency दिखा। सुसंस्कृत ऊतक केंद्रीय नहर 6,7 के क्षेत्रों में शामिल हैं जब multipotent, स्वयं renewing NSPCs वयस्क कृंतक से रीढ़ की हड्डी को अलग किया और संवर्धित किया जा सकता है। अन्य क्षेत्रों से कोशिकाओं को पैदा करने के लिए विरोध के रूप में वयस्क रीढ़ की हड्डी से उत्पन्न NSPCs का उपयोग करने में एक संभावित लाभ इन ऊतक विशेष कोशिकाओं को सबसे अधिक बारीकी से चोट या बीमारी निम्नलिखित खो दिया है या क्षतिग्रस्त हो रहे हैं कि रीढ़ की हड्डी में कोशिकाओं जैसा दिख रहा है।
पिछला काम वयस्क मानव रीढ़ की हड्डी से व्युत्पन्न neurospheres के लिए लंबे समय तक प्रचारित या कोशिकाओं 8,9 के लिए पर्याप्त संख्या उत्पन्न करने के लिए passaged नहीं किया जा सका है कि दिखाया। हालांकि, संवर्धन की स्थिति में संशोधनों के साथ, हम प्रदर्शन, वयस्क मानव रीढ़ की हड्डी व्युत्पन्न NSPCs के विस्तार और प्रत्यारोपण की रिपोर्ट है कि स्वयं renewingऔर multipotent NSPCs अंग प्रत्यारोपण दाताओं 10 के वयस्क मानव रीढ़ की हड्डी से अलग किया जा सकता है। जाहिर है, विकास का पहलू समृद्ध माध्यम में एक पक्षपाती सब्सट्रेट पर विच्छेदन और इन कोशिकाओं संवर्धन के दौरान सफेद पदार्थ के सबसे को हटाने के वयस्क मानव रीढ़ की हड्डी NSPCs proliferating के लिए चुना। इस प्रोटोकॉल में हम वयस्क चूहे से और मानव अंग प्रत्यारोपण दाताओं, periventricular ऊतक के विच्छेदन, और NSPCs के अलगाव, संस्कृति और विस्तार से रीढ़ की हड्डी की कटाई का वर्णन है।
Protocol
Representative Results
Discussion
चूहे रीढ़ की हड्डी के ऊतकों की देखभाल के विच्छेदन के दौरान laminectomy प्रदर्शन करते हुए रीढ़ की हड्डी को नुकसान नहीं लिया जाना चाहिए। यह रीढ़ की हड्डी खंडों बरकरार हैं जब periventricular ऊतक को अलग करने के लिए आसान है। ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge support from Spinal Cord Injury Ontario, the Ontario-China Research and Innovation Fund, the Toronto General and Western Hospital Foundation, and Physicians’ Services Incorporated Foundation. The authors thank Dr. Tasneem Zahir for expert advice in human spinal cord NSPC culture, and Drs. Cindi Morshead and Iris Kulbatski for their expert advice in rat spinal cord NSPC isolation.
Materials
| 1X PBS | Life Technologies | #10010023 | Dissection buffer |
| 1X HBSS | Life Technologies | #14175095 | Dissection buffer |
| D-glucose | Sigma | # G-6152 | Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140-148 | Dissection buffer and culture medium |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 | Culture medium |
| L-glutamine, 200mM | Life Technologies | #25030-081 | Culture medium |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Culture medium |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Hormone mix |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | Hormone mix |
| NaHCO3 | Sigma | # S-5761 | Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix |
| Insulin | Sigma | #I-5500 | Hormone mix |
| Apo-transferrin | Sigma | #T-2252 | Hormone mix |
| Putrescine | Sigma | # P7505 | Hormone mix |
| Selenium | Sigma | #S-9133 | Hormone mix |
| Progesterone | Sigma | #P-6149 | Hormone mix |
| EGF, mouse | Sigma | #E4127 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| EGF, human recombinant | Sigma | #E9644 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| bFGF, human recombinant | Sigma | #F0291 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| Heparin, 10000U | Sigma | #H3149 | Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA |
| Sodium Pentobarbital | Bimeda – MTC Animal Health Inc | DIN 00141704 | |
| Tissue Forceps: Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | Serrated standard tip; micro-tip also available |
| Fine Forceps: Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | #15024-10 | Round-handled Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Lomb | N1430 | |
| 10mm Petri dishes | Nunc | 1501 | |
| T25 Culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 40 μm nylon cell strainer | VWR | CA21008-949 | |
| 6 well plates | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, growth factor reduced (100X) | Corning | 354230 | Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM |
References
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