La moelle épinière de mammifère adulte contient des cellules souches neurales/progénitrices (NSPC) qui peuvent être isolées et développées en culture. Ce protocole décrit le prélèvement, l’isolement, la culture et le passage de NSPC générés à partir de la région périventriculaire de la moelle épinière adulte à partir de rats et de donneurs d’organes humains.
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Article de méthode
Isolement de neurones cellules souches / progénitrices de la région périventriculaire du Rat des adultes et de la moelle épinière humaine
Dans cet article
Résumé
Résumé
Rat adulte et les cellules humaines de la moelle épinière neurales souches / progénitrices (NSPCs) cultivées dans un milieu de croissance enrichi en facteur permet la prolifération des multipotentes, et les cellules souches neurales expansibles auto-renouvellement. Dans des conditions sérum, ces NSPCs multipotentes seront différencier, générer des neurones, des astrocytes et des oligodendrocytes,. Le tissu prélevé est enzymatiquement dissocié dans une solution de papaïne-EDTA et ensuite dissocié mécaniquement et séparés par un gradient de densité discontinu pour obtenir une suspension cellulaire unique, qui est plaqué dans un milieu neurobasal additionné de facteur de croissance épidermique (EGF), facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF ), et de l'héparine. Rats adultes de la moelle épinière NSPCs sont cultivées comme neurosphères flottants et adultes humains NSPCs de la moelle épinière sont cultivées comme cultures adhérentes. Dans ces conditions, adultes de la moelle épinière NSPCs prolifèrent, marqueurs expresses de cellules précurseurs, et peuvent être élargies en permanence lors du passage. Ces cellules peuvent be étudiée in vitro en réponse à divers stimuli, et des facteurs exogènes peuvent être utilisés pour promouvoir restriction de la lignée d'examiner la différenciation des cellules souches neurales. Multipotentes NSPCs ou leur progéniture peuvent également être transplantées dans divers modèles animaux pour évaluer la réparation régénérative.
Introduction
NSPCs cellules multipotentes sont commis à la lignée de neurones qui peut auto renouveler et élargir facilement in vitro. Nous nous référons à ces cellules comme une population mixte de cellules souches / progénitrices neurales car ils présentent des propriétés de cellules souches multipotentes auto-renouvellement et les progéniteurs plus restreints. NSPCs se trouvent à la fois dans le cerveau du fœtus et de l'adulte et la moelle épinière 1,2. Chez l'adulte, NSPCs sont normalement repos et résident dans des niches spécifiques, y compris la zone sous-ventriculaire qui tapisse les ventricules latéraux 2-4, et dans la région périve....
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Protocole
Toutes les procédures d'animaux sont approuvés par le Comité de protection des animaux de l'University Health Network, Toronto ON Canada, en conformité avec les politiques établies dans le Manuel sur le soin et l'utilisation des animaux d'expérimentation préparés par le Conseil canadien de protection des animaux. Pour la récolte de tissus de la moelle épinière humaine, l'approbation a été obtenue du comité d'éthique de la recherche du University Health Network et de la Trillium-cadeau Life Foundation qui supervise le don d'organes en Ontario, Canada.
1. Préparation de dissection tampons et de la culture des média....
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Résultats
Rats adultes de la moelle épinière cellules cultivées dans une culture en suspension dans un milieu EFH se former de petites neurosphères (colonies de cellules non différenciées) dans 1 semaine de placage initial. Dans les cultures primaires, la plupart des cellules étalées mourront et les cellules souches du facteur sensible croissance va proliférer et sont choisis dans le milieu EFH. Par passage 3, il y aura de nombreux neurosphères flottant librement à environ 100 m de diamètre (figure 2A). Neurosphè.......
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Discussion
Au cours de la dissection de la moelle épinière soins de tissu de rat doivent être prises pour ne pas endommager la moelle épinière tout en effectuant la laminectomie. Il est plus facile d'isoler le tissu périventriculaire lorsque les segments de la moelle épinière sont intacts. Les segments de tissus devraient être complètement immergés dans un tampon de dissection et les méninges recouvrant la matière blanche et peuvent être découpées en bandes longitudinales avec microciseaux. Alternativement, forceps de tissu fi.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs tiennent à souligner le soutien de Lésions médullaires Ontario, du Fonds de recherche et d’innovation Ontario-Chine, de la Fondation de l’Hôpital général et occidental de Toronto et de la Fondation Physicians' Services Incorporated. Les auteurs remercient le Dr Tasneem Zahir pour ses conseils d’expert sur la culture NSPC de la moelle épinière humaine, et les Drs Cindi Morshead et Iris Kulbatski pour leurs conseils d’experts sur l’isolement NSPC de la moelle épinière du rat.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1x PBS | Life Technologies | #10010023 | Tampon de dissection |
| 1x HBSS | Life Technologies | #14175095 | Tampon de dissection |
| D-glucose | Sigma | # G-6152 | Préparez une solution mère de glucose à 30 % pour le tampon de dissection et le mélange d’hormones |
| Pénicilline-Streptomycine | Life Technologies | #15140-148 | Tampon de dissection et milieu de culture |
| Neurobasale-A ; | Life Technologies | #10888-022 | Milieu de culture |
| L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | #25030-081 | Milieu de culture |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Milieu de culture |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Mélange d’hormones |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | Mélange d’hormones |
| NaHCO 3 | Sigma | # S-5761 | Préparer une solution mère de NaHCO3 pour mélange d’hormones |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Préparer 1M de solution mère HEPES pour un mélange d’hormones |
| Insuline | Sigma | #I-5500 | Mélange d’hormones |
| Apo-transferrine | Sigma | #T-2252 | Mélange d’hormones |
| Putrescine | Sigma | # P7505 | Hormone mélange |
| Sélénium | Sigma | #S-9133 | Mélange d’hormones |
| Progestérone | Sigma | #P-6149 | Mélange d’hormones |
| EGF, souris | Sigma | #E4127 | Préparer 100 &mu ; g/ml de stocks en B27 et en aliquote ; EFH moyen |
| EGF, humain recombinant | Sigma | #E9644 | Préparer 100 &mu ; g/ml de stocks en B27 et en aliquote ; EFH moyen |
| bFGF, humain recombinant | Sigma | #F0291 | Préparer 100 &mu ; g/ml de stocks en B27 et en aliquote ; EFH moyen ; |
| Héparine, 10 000 U | Sigma | #H3149 | Préparez des stocks de 27,3 mg/ml dans un mélange d’hormones et une aliquote ; |
| Kit de dissociation de la papaïne | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contient de l’EBSS, de la papaïne, de la DNase, un inhibiteur de la protéase ovomucoïde avec BSA |
| Sodium Pentobarbital | Bimeda &ndash ; MTC Animal Health Inc | Pince à tissus DIN 00141704 | |
| Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 ; | Pointe standard dentelée ; micro-pointe également disponible |
| Pince fine : Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| Microciseaux | Fine Science Tools | #15024-10 | Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Lomb | N1430 | |
| 10 mm Boîtes de Pétri | Nunc | 1501 | |
| T25 Fioles de culture | Nunc | 156367 | |
| 40 &mu ; m crépine à cellules en nylon | VWR | CA21008-949 | |
| 6 plaques de puits | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, facteur de croissance réduit (100x) | Corning | 354230 | Décongeler selon les instructions et congeler les aliquotes ; utilisation diluée dans un rapport de 40 &mu ; l Matrigel : 1 ml de SFM |
Références
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al.<....
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Réimpressions et autorisations
