يعيش التصوير خلية خلال الإمتداد الميكانيكية
Summary
A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.
Abstract
There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.
Introduction
تتعرض الخلايا لالأحمال الميكانيكية في العديد من الأنسجة، ولقد ثبت هذا التحفيز الميكانيكي لتعزيز التغييرات في أنماط التعبير الجيني، وإطلاق سراح من عوامل النمو، السيتوكينات، أو إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية والهيكل الخلوي 1-4. الإشارات بين الخلايا transduced من هذه المحفزات الميكانيكية تحدث من خلال عملية mechanotransduction 5-7. في الجهاز التنفسي، نتيجة واحدة من mechanotransduction هي زيادة في أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) 8،9 والسيتوكينات الموالية للالتهابات 10 في الخلايا الظهارية الرئوي في وجود دوري سلالة الشد. أدلة قوية تشير أيضا إلى أن الإفراط في الضغط الشد يؤدي إلى ضرر مباشر على ظهارة السنخية، بالإضافة إلى ردود البيوكيميائية للخلايا 11-14. على الرغم من أن التركيز هنا ينصب بالدرجة الأولى على استجابة خلايا الرئة إلى تشويه الميكانيكية، ومسارات الناجمة عن mechanotransduction تلعب دورا رئيسيا في BASجيم ظيفة العديد من الأنسجة في جسم الإنسان، بما في ذلك تنظيم الأوعية الدموية لهجة 15 ووضع لوحة النمو 16.
وقد أدى الاهتمام المتزايد في mechanotransduction في تطوير العديد من الأجهزة لتطبيق الأحمال الميكانيكية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية للخلايا المستزرعة والأنسجة. على وجه الخصوص، وأجهزة تطبيق إجهاد الشد، وهو شكل شائع من تحميل الميكانيكية التي يعاني منها الأنسجة، وتحظى بشعبية 11،17-19. ومع ذلك، فإن العديد من الأجهزة المتوفرة مصممة إما مفاعل حيوي لتطبيقات هندسة الأنسجة أو لا تفضي إلى التصوير في الوقت الحقيقي مع التمدد. على هذا النحو، هناك حاجة إلى تطوير الأدوات والأساليب التي يمكن تصور الخلايا والأنسجة في التوتر لتسهيل التحقيق في ممرات mechanotransduction.
هنا، تم تصميم جهاز تمتد في الطائرة الميكانيكية وتم تطوير بروتوكولات لتطبيق مأشكال ultiple من سلالة إلى الأنسجة والخلايا في حين يسمح التصوير من الاستجابات الكيميائية الحيوية والميكانيكية في الوقت الحقيقي (الشكل 1A-D). ويستخدم الجهاز ستة المشابك متباعدة بشكل متساو ترتيب محيطي لفهم غشاء مرن وتطبيق في الطائرة، وانتفاخ شعاعي تصل إلى ما يقرب من 20٪ (الشكل 1B). يمكن وضعها الجهاز المشغلات في حاضنة الثقافة خلية لفترة طويلة من الزمن، في حين يتم وضع المحرك (الشكل 1C) خارج الحاضنة والتي تسيطر عليها البرمجيات الاحتكارية التي يقدمها المورد المحرك. ويرتبط المحرك للسائق الخطي، والتي تدور على كام الداخلية، والقيادة المشابك نقالة ستة موحد في التوتر والاسترخاء.
بالإضافة إلى جهاز ميكانيكي، تم إنشاء أغشية مرنة مخصصة من المتاحة تجاريا ثقافة الخلية أغشية جاهزة لاستخدامها في نظام ميكانيكي. الجدران ثم دائرية (التي يبلغ قطرها حوالي28 ملم) وقدمت ويعلق على لغشاء مرن بحيث يمكن زرع خلايا فقط في هذه المنطقة من موصوفة وصفا جيدا الشخصي سلالة. من أجل تحديد ما إذا كان وضع هذه الأغشية داخل الجهاز المشغلات من شأنه أن يوفر سلالة موحد وموحد الخواص في وسط الغشاء مرنا، أجري تحليل العناصر المحدودة باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا (الشكل 1E-F). وعلى غرار غشاء مرن مع شروط الحدود المتماثلة والاستفادة من جميع العناصر الرباعية للشبكة. حلقات متحدة المركز ينظر في المؤامرة كفاف من أقصى سلالة الرئيسي هو مبين في الشكل 1F تشير إلى توزيع الخواص من سلالة.
وقد تم قياس الإجهاد التي يعاني منها الغشاء عن طريق تسجيل الصور من علامات عن طريق التحميل (الشكل 2). ويبين الشكل 2D أن متوسط سلالة غشاء تقاس شعاعي ومحوري الاتجاهات وكان ما يقرب من الخطيةفيما يتعلق المحرك تطبيقها تعول ما يصل الى سلالة خطي الحد الأقصى من 20٪. لم يكن هناك فرق كبير بين مستويات الإجهاد خلال قياس انتفاخ مقارنة مع تلك التي تقاس خلال التراجع مرة أخرى إلى موقف يستريح. بعد ذلك، تم قياس تشريد الخلايا البشرية القصبية الظهارية (16HBE) والنواة مثقف على الغشاء مخصصة مرونة. تم تصوير fluorescently المسمى (دابي) نوى الخلايا 16HBE باستخدام الهدف 20X تحت المجهر متحد البؤر، في حين تم قياس النزوح خلية كاملة مع الصور الطوري سجلت مع المجهر الرقمي. كما رأينا في الشكل (3)، وكان من سلالة تقاس تشريد النوى مماثلة لتلك التي تقاس تشريد علامات على الغشاء، وتصل إلى 20٪ ~ سلالة الخطي. هذا يؤكد أن سلالة تطبيقها على الأغشية وأحيلت إلى الخلايا الملتصقة. البروتوكولات واصفا استخدام الجهاز مخصص على المجهر التقليدي وmicroscop القوة الذريةيتم توفير البريد في الخطوات التالية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم تطوير جهاز فريد من نوعه لتصوير الخلايا الحية خلال تمتد الميكانيكية. وهذا الجهاز كان يستخدم في البروتوكول لدراسة الظهارية الرئة ذي الخلية mechanobiology. في الدراسات الأولية، تبين أن شريط واحد عقد حفز إنتاج الفائق الميتوكوندريا في الخلايا الظهارية القصبية. بالإضافة …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر معهد فيديكس للتكنولوجيا في جامعة ممفيس لدعمهم. فإن الكتاب أن نعترف طلاب المجموعة مشروع تصميم العليا في قسم الهندسة الميكانيكية في جامعة ممفيس (ديفيد باتلر، جاكي كارتر، دومينيك كليفلاند، يعقوب شافير)، دانيال كوهن من قسم جامعة ممفيس للهندسة والتكنولوجيا التحكم في المحركات ، والدكتور عمر بن تنغ والسيدة Charlean Luellen لمساعدتهم في زراعة الخلايا. وأيد هذا العمل من قبل K01 HL120912 (ER) وR01 HL123540 (CMW).
Materials
| SmartMotor NEMA 34: 3400 Series | MOOG Animatics | SM3416D | Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus |
| Flexcell Membrane (Collagen I coated) | Flexcell International Corp | SM2-1010C | 3.5×5.25×0.020" |
| Sylgard 184 | Dow Corning Corporation | 10:1 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | H1399 | DAPI stain |
| MitoSOX | Sigma-Aldrich | M36008 | |
| Tiron | Sigma-Aldrich | D7389 | mitochondrial superoxide label |
| DMEM | superoxide inhibitor | ||
| FBS | |||
| HEPES | |||
| 50 ml tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | Any centriguge tube can be used to create an area for imaging. |
| Hybridization oven | Bellco Glass | ||
| MLE12 Cells | ATCC | CRL-2110 | Mouse Lung Epithelial Cells |
| 16HBE cells | ATCC | CRL-2741 | Human Bronchial Epithelial Cells |
| AFM Indentation Experiments | |||
| Cantilever Beams for Nano-indentation | Budget Sensors | Si-Ni30 | |
| AFM | Asylum Research | MFP3D | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-71 | Inverted microscope with 20X and 40X objectives. |
| AFM Leg Extenders | Asylum Research | Not available | AFM microscope |
| Finite Element Analyses | |||
| ABAQUS | Simulia | 6.12 | |
| Software | |||
| ImageJ | NIH | ||
| Microscopes | |||
| Digital microscope | Life Technologies | EVOS XL Core | Initially a self standing company, now owned by Life Technologies. |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | 2-photon upright microscope |
References
- Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology. J Biomech. 43, 99-107 (2010).
- Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. . Comprehensive Physiology. , (2011).
- Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development. Current Biology. 24, R495-R501 (2014).
- Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475, 316-323 (2011).
- Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
- Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Waters, C. M. Reactive oxygen species in mechanotransduction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).
- Chapman, K. E., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
- Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines. Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).
- Tschumperlin, D., Margulies, S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
- Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. Cellular stress failure in ventilator-injured lungs. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).
- Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).
- Gamerdinger, K., et al. Mechanical load and mechanical integrity of lung cells – Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers. J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).
- Hayashi, K., Naiki, T. Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension. J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).
- Villemure, I., Stokes, I. Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding. J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).
- Waters, C. M., et al. A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells. J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).
- Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression. J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).
- Dassow, C., et al. A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).
- Chapman, K., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
- Birukov, K. G. Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).
- Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, 335-344 (2003).
- Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
- Pouvreau, S. Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently. PLoS One. 5, (2010).
- Yalcin, H. C., et al. Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).
- Jacob, A. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4. J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).
- DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).
