A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.
There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.
कोशिकाओं कई ऊतकों में यांत्रिक लोड के अधीन हैं, और इस यांत्रिक उत्तेजना जीन अभिव्यक्ति, विकास कारकों, साइटोकिन्स, या बाह्य मैट्रिक्स के पुनर्गठन की रिहाई के पैटर्न में बदलाव को बढ़ावा देने और 1-4 cytoskeleton दिखाया गया है। ऐसी यांत्रिक उत्तेजनाओं से transduced इंट्रासेल्युलर संकेतों mechanotransduction 5-7 की प्रक्रिया के माध्यम से होते हैं। श्वसन प्रणाली में, mechanotransduction का एक परिणाम प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) चक्रीय तन्यता तनाव की उपस्थिति में फेफड़े के उपकला कोशिकाओं में 8,9 और समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स 10 में वृद्धि हुई है। पुख्ता सबूत भी अत्यधिक तन्यता तनाव कोशिकाओं 11-14 के जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं के अलावा, वायुकोशीय उपकला को चोट निर्देशित करने के लिए ले जाता है कि पता चलता है। फोकस यहां यांत्रिक विरूपण करने के लिए फेफड़ों की कोशिकाओं की प्रतिक्रिया पर मुख्य रूप से है, mechanotransduction द्वारा प्रेरित रास्ते बस में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैंसंवहनी स्वर 15 के नियमन और विकास की थाली 16 के विकास सहित मानव शरीर में कई ऊतकों के आईसी समारोह।
mechanotransduction में बढ़ती रुचि संवर्धित कोशिकाओं और ऊतकों को physiologically प्रासंगिक यांत्रिक लोड के आवेदन के लिए कई उपकरणों के विकास में हुई है। विशेष रूप से, ऊतक द्वारा अनुभवी मैकेनिकल लोडिंग के एक आम रूप है, जो एक तन्यता तनाव, लागू करने, उपकरणों 11,17-19 लोकप्रिय हैं। हालांकि, उपलब्ध उपकरणों से कई या तो ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए एक बायोरिएक्टर के रूप में बनाया गया है या खिंचाव के साथ वास्तविक समय इमेजिंग के लिए अनुकूल नहीं हैं। जैसे, mechanotransduction के रास्ते की जांच की सुविधा के लिए तनाव में कोशिकाओं और ऊतकों कल्पना कर सकते हैं कि उपकरणों और तरीकों को विकसित करने की आवश्यकता है।
इस के साथ साथ, एक में विमान यांत्रिक खींच डिवाइस तैयार किया गया था और प्रोटोकॉल एम लागू करने के लिए विकसित किए गएएकाधिक ऊतकों को तनाव के रूपों और कोशिकाओं वास्तविक समय (चित्रा 1 ए डी) में जैव रासायनिक और यांत्रिक प्रतिक्रियाओं की इमेजिंग की इजाजत दी। इस उपकरण में एक लचीला झिल्ली समझ और लगभग 20% (चित्रा 1 बी) के लिए एक में विमान, रेडियल फैलावट ऊपर लागू करने के लिए circumferentially व्यवस्था की छह समान स्थान clamps के इस्तेमाल करता है। मोटर (चित्रा 1C) इनक्यूबेटर के बाहर तैनात है और मोटर सप्लायर द्वारा प्रदान मालिकाना सॉफ्टवेयर के द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जबकि actuating डिवाइस, समय की एक विस्तारित अवधि के लिए एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखा जा सकता है। मोटर तनाव और तनाव कम करने में समान रूप से छह स्ट्रेचर clamps के ड्राइविंग, एक आंतरिक कैम घूमता है जो एक रेखीय ड्राइवर, से जुड़ा है।
यांत्रिक उपकरण के अलावा, अनुकूलित लचीला झिल्ली यांत्रिक प्रणाली में इस्तेमाल किया जा करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल संस्कृति तैयार झिल्ली से बनाए गए थे। लगभग की एक व्यास के साथ फिर परिपत्र दीवारों (28 मिमी) बना दिया है और कोशिकाओं को ही अच्छी तरह से वर्णित तनाव प्रोफ़ाइल के इस क्षेत्र में संवर्धित किया जा सकता है कि इतना लचीला झिल्ली पर जुड़े थे। Actuating डिवाइस के भीतर इन झिल्लियों की नियुक्ति लचीला झिल्ली के केंद्र में वर्दी और isotropic तनाव प्रदान करेगा कि क्या यह निर्धारित करने के लिए, परिमित तत्व विश्लेषण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर (चित्रा 1E-एफ) का उपयोग किया गया था। लचीला झिल्ली सममित सीमा की स्थिति और जाल के लिए सभी चतुर्भुज तत्वों के उपयोग के साथ मॉडलिंग की थी। चित्रा 1F में दिखाया अधिकतम प्रिंसिपल तनाव के समोच्च साजिश में देखा गाढ़ा छल्ले तनाव की isotropic वितरण संकेत मिलता है।
झिल्ली द्वारा अनुभवी तनाव लोड हो रहा है (चित्रा 2) के माध्यम से चिह्नों की छवियों की रिकॉर्डिंग के द्वारा मापा गया था। चित्रा 2 डी रेडियल और अक्षीय दिशा-निर्देश में मापा औसत झिल्ली तनाव लगभग रैखिक था कि पता चलता हैलागू की मोटर के संबंध में 20% की एक अधिकतम रैखिक तनाव अप करने के लिए मायने रखता है। वापस आराम की स्थिति को त्याग के दौरान मापा उन के साथ तुलना फैलावट दौरान मापा तनाव के स्तर के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। अगला, कस्टम लचीला झिल्ली पर सुसंस्कृत मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं (16HBE) और उनके नाभिक के विस्थापन मापा गया। पूरे सेल विस्थापन एक डिजिटल माइक्रोस्कोप के साथ दर्ज चरण विपरीत छवियों के साथ मापा गया था जबकि 16HBE कोशिकाओं fluorescently लेबल (DAPI) नाभिक, एक confocal खुर्दबीन के नीचे एक 20x उद्देश्य का उपयोग imaged थे। चित्रा 3 में देखा, नाभिक के विस्थापन से मापा जाता है तनाव, अप करने के लिए ~ 20% रैखिक तनाव झिल्ली पर चिह्नों के विस्थापन से मापा जाता है कि इसी तरह की थी। यह झिल्ली के लिए लागू तनाव पक्षपाती कोशिकाओं को प्रेषित किया गया है कि पुष्टि करता है। एक पारंपरिक माइक्रोस्कोप पर कस्टम उपकरण के उपयोग का वर्णन प्रोटोकॉल और एक परमाणु शक्ति microscopई निम्न चरणों में प्रदान की जाती हैं।
यांत्रिक खंड के दौरान जीवित कोशिका इमेजिंग के लिए एक अद्वितीय उपकरण विकसित किया गया था; और इस डिवाइस फेफड़ों के उपकला कोशिका mechanobiology अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया था। प्रारंभिक अ…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों के उनके समर्थन के लिए मेम्फिस के विश्वविद्यालय में प्रौद्योगिकी के फेडेक्स संस्थान को धन्यवाद कि चाहते हैं। लेखकों मेम्फिस (डेविड बटलर, जैकी कार्टर, डोमिनिक क्लीवलैंड, याकूब शैफर) विश्वविद्यालय में मैकेनिकल इंजीनियरिंग विभाग में वरिष्ठ डिजाइन परियोजना के समूह के छात्रों को स्वीकार करना चाहते हैं, मोटर नियंत्रण के लिए विश्वविद्यालय मेम्फिस के इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकी विभाग की ओर से डेनियल कोह्न सेल संस्कृति में उनकी मदद के लिए, और डॉ बिन टेंग और सुश्री Charlean Luellen। इस काम K01 HL120912 (ईआर) और R01 HL123540 (CMW) द्वारा समर्थित किया गया।
SmartMotor NEMA 34: 3400 Series | MOOG Animatics | SM3416D | Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus |
Flexcell Membrane (Collagen I coated) | Flexcell International Corp | SM2-1010C | 3.5×5.25×0.020" |
Sylgard 184 | Dow Corning Corporation | 10:1 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | H1399 | DAPI stain |
MitoSOX | Sigma-Aldrich | M36008 | |
Tiron | Sigma-Aldrich | D7389 | mitochondrial superoxide label |
DMEM | superoxide inhibitor | ||
FBS | |||
HEPES | |||
50 ml tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | Any centriguge tube can be used to create an area for imaging. |
Hybridization oven | Bellco Glass | ||
MLE12 Cells | ATCC | CRL-2110 | Mouse Lung Epithelial Cells |
16HBE cells | ATCC | CRL-2741 | Human Bronchial Epithelial Cells |
AFM Indentation Experiments | |||
Cantilever Beams for Nano-indentation | Budget Sensors | Si-Ni30 | |
AFM | Asylum Research | MFP3D | |
Olympus microscope | Olympus | IX-71 | Inverted microscope with 20X and 40X objectives. |
AFM Leg Extenders | Asylum Research | Not available | AFM microscope |
Finite Element Analyses | |||
ABAQUS | Simulia | 6.12 | |
Software | |||
ImageJ | NIH | ||
Microscopes | |||
Digital microscope | Life Technologies | EVOS XL Core | Initially a self standing company, now owned by Life Technologies. |
Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | 2-photon upright microscope |